survivin在非小细胞肺癌中表达的意义及其与caspase?3、DFF45蛋白之间的相互关系

【摘要】  探讨survivin蛋白的表达在非小细胞肺癌(NSCLC)发生、方面的作用及其与临床病理特征之间的联系，与caspase?3及DFF45表达的相互关系。方法 运用免疫组织化学SP法对60例NSCLC、10例淋巴结转移癌、10例正常支气管粘膜上皮石蜡切片组织中survivin、caspase?3及DFF45蛋白的表达进行检测。结果 NSCLC、淋巴结转移癌中survivin的阳性表达率分别为70％及90％，显著高于正常支气管粘膜上皮的阳性率10％（P＜0.01）。survivin在NSCLC中的表达与分化程度（P＜0.01）、TNM分期（P＜0.05）、淋巴结转移（P＜0.05）有关。而与年龄、性别、病理类型无明显相关（P＞0.05）。survivin表达与caspase?3的表达呈负相关（P＜0.01；r=－0.335），而与DFF45的表达却呈正相关（P＜0.01；r＝0.406）。结论 survivin在NSCLC的发生、发展中起重要作用，可作为NSCLC的诊断指标，对NSCLC恶性程度的判断及预后也有一定价值。survivin的作用是通过抑制caspase?3 的表达，从而影响下游凋亡途径而发挥作用的。

【关键词】  非小细胞肺癌 survivin 细胞凋亡 免疫组织化学

　　0  引言
   
　　自从1997年Ambrosini等[1]首次发现survivin与肿瘤的关系后，其日益成为肿瘤研究热点。survivin属于凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族新成员，是具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双功能蛋白。survivin选择性表达于包括肺癌在内的绝大多数恶性肿瘤，IAPs在凋亡途径的高度保守步骤是抑制效应酶caspase?3等的活化或催化底物的活性，而使凋亡发生抑制。Shin等[2]进一步研究认为 survivin的二聚体与caspase二聚体以均称对等方式结合而抑制后者活性，caspase无法降解底物，从而使凋亡无法执行。本研究运用免疫组化SP法探讨survivin在肺癌中表达的意义及与临床病理特征的联系，在这方面目前观点不一，对肺癌中survivin表达与caspase?3 、DFF45蛋白之间关系的研究目前也报道不多，本研究旨在为肺癌的诊断、提供另一思路。

　　1  资料和方法

　　1.1  标本来源
   
　　80例标本随机取自湖北省肿瘤和东风总医院1999～2003年间病理存档的石蜡标本，所有手术患者术前均未接受过放、化疗，诊断均经常规病理切片证实，其中男43例，女37例，年龄35～76岁，平均年龄63岁。其中正常支气管粘膜上皮10例，淋巴结转移癌10例，60例NSCLC。

　　1.2  试剂
   
　　兔抗人survivin多克隆抗体、鼠抗人caspase?3单克隆抗体均为美国SantaCruz公司的产品，兔抗人DFF45多克隆抗体和超敏SP试剂盒均为即用型，均购自北京中杉生物技术公司。

　　1.3  方法
   
　　采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化酶连接(SP)染色法检测蛋白的表达，survivin抗体（高压修复，工作浓度为1∶100），caspase?3抗体(微波修复，工作浓度为1∶100)和DFF45抗体(高压修复)。用PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性片作阳性对照。三种蛋白均采用37℃孵育1h，再放入4℃冰箱过夜，DAB显色，苏木素复染。

　　1.4  结果判断
   
　　survivin主要以胞浆中出现粗细不一的棕黄色为主，caspase?3蛋白表达以胞浆内出现弥漫的棕黄色颗粒为主，DFF45蛋白表达主要是胞核呈棕黄色或棕褐色。在此基础上，参照[3，4]评分方法，首先将染色强度评为1～4分；再按阳性细胞所占的百分比评为0～4分。染色强度与阳性细胞的分值相加，≥3分为阳性(+)，每张切片选择有代表性的区域，在400倍视野下计数，共计5个视野，取其平均值，避免随意性。

　　1.5  统计学方法
   
　　所得数据用阳性率(%)表示，采用SPSS11. 5软件进行χ2检验和Pearson相关分析。P＜0.05为统计学差异有显著性。

　　2  结果

　　2.1  survivin蛋白的表达及意义
   
　　survivin蛋白主要表达在肿瘤细胞胞浆中成棕黄色，见图1。由表1可见，survivin在正常支气管粘膜上皮表达与肺癌组织、淋巴结转移癌中的表达差异有极显著性（P＜0.01）。

　　2.2  survivin的表达与肺癌临床病理特征的联系
   
　　由表2可见，survivin的表达与NSCLC的分化程度、TNM分期、淋巴结转移均相关(P＜0.05)，而与肺癌患者的年龄、性别、病理类型无明显相关性（P＞0.05）。

　　表1  不同病变阶段survivin的表达（略）

　　*与正常支气管粘膜上皮比较，P＜0.01

　　表2  肺癌中survivin表达与临床病理特征的联系及与caspase?3、DFF45蛋白表达的关系（略）

　　2.3  肺癌中survivin的表达与caspase?3、DFF45之间的关系
   
　　caspase?3在肿瘤细胞胞浆中弥漫表达，见图2， DFF45主要在肿瘤细胞的胞核中呈棕黄色着色，见图3。
   
　　由表2可见，在肺癌组织中，在survivin表达阳性的42例样本中有27例caspase?3表达阴性，而在18例survivin表达阴性的样本中13例caspase?3表达阳性，可见survivin表达与caspase?3的表达呈显著负相关（P＜0.01；r=－0.335）。在survivin表达阳性的42例样本中23例DFF45表达阳性，而在survivin表达阴性的18例样本中有16例DFF45表达阴性，两者呈正相关（P＜0.01；r＝0.406）。  

　　3  讨论
   
　　survivin是一个新发现的凋亡蛋白抑制(IAP)家族成员，表达于胚胎和发育的胎儿组织，但不表达于成人终末分化组织，只有在病理情况下表达于大多数恶性肿瘤，也说明survivin在肿瘤的发病机制中有重要作用。在本研究中发现survivin在正常支气管粘膜的表达与肺癌、淋巴结转移癌差异有显著性，说明survivin的表达上调在肺癌的发生中起着相当重要的作用，可作为NSCLC的诊断指标。survivin的表达与年龄、性别、病理类型无明显相关性，但随着分化程度的降低，survivin表达逐渐升高，说明survivin表达与分化程度有相关性，而分化程度越低，恶性程度越高，预后就越差。在有淋巴结转移的27例标本中23例survivin表达阳性，仅4例表达阴性，阳性率为85.2％，与淋巴结无转移组阳性率57.6%相比差异有显著性，说明survivn表达与淋巴结转移有相关性。TNM分期越晚，组织分级恶性度越高，survivin阳性表达率也越高，survivin表达与TNM也有相关性。Kren等[5]研究了102例非小细胞肺癌中survivin的表达与病人生存率之间的关系，结果表明，survivin是个独立的预后判断因素。因此survivin的表达对肺癌恶性程度的判断及肺癌的预后可能有一定价值。
   
　　caspase?3的蛋白酶解级联反应控制着凋亡的发生发展，在其中发挥了重要作用，是凋亡发生不可缺少的效应[6]。Ikehara等[4]认为survivin是作用于caspase?3和caspase?7，即直接作用于级联反应的最终效应蛋白。本研究发现survivin表达阳性的42例中27例caspase?3表达阴性，18例survivin表达阴性的肺癌中13例caspase?3表达阳性，说明survivin与caspase?3呈负相关，survivin表达上调，通过作用效应蛋白caspase?3，导致其无法降解底物，不能释放引起细胞凋亡的酶，从而使凋亡小体无法形成。
   
　　DNA裂解因子（DNA fragmentationfactor，DFF)是由分子量分别为45kD和40kD两个亚单位组成的异源二聚体[7]。在细胞凋亡信号启动的caspase级联活化过程中作为下游caspase的底物被活化并形成脱氧核糖核酸酶(DNase)，从而介导并调节DNA断裂和染色质的凝聚。Sharif等[8]研究发现DFF45在体内和体外均可被粒酶B（GrB）直接裂解，GrB裂解DFF45的位点与caspase?3裂解DFF45的位点完全相同。本研究中发现在survivin表达阳性的42例样本中有23例DFF45表达阳性，而在survivin阴性的18例中有16例DFF45表达阴性，共同阳性表达23例，共同阴性表达16例，两者呈正相关（P＜0.05；r＝0.406）。与陶琳等[9]的研究结果相符：封闭或下调survivin的表达水平，恢复凋亡调控机制，可能成为肺癌的新思路。

【】
  　　［1］ Ambrosini G, Adida C, Altier Dc, et al. A novel anti?apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma[J]. Nat Med, 1997, 3(8): 917?921.

　　[2] Shin S, Sung BJ, Cho YS, et al. An Aneli?apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of Caspase?3 and ?7[J]. Biochemistry , 2001, 40(4): 1117?1123.

　　[3] Torm anen?Napankangas U, Soini Y, Kahlosa K, et al. Expression of caspases?3, ?6 and their relation to apoptosis in non?small cell lung carcinoma[J]. Cancer, 2001, 93(2): 192?198.

　　[4] Ikehara M, Oshita F, Kameda Y, et al. Expression of surviving correlated with vessel invasion is a marker of poor prognosis in small adenocarcinoma of the lung[J]. Oncol Rep, 2002, 9(4): 835?838.

　　[5] Kren L, Brazdil J, Hermanova M, et al. Prognostic significance of anti?apoptosis proteins survivin and bcl?2 in non?small?cell lung carcinomas: a clinicopathologic study of 102 cases[J]. App1 Immunohistochem Mol Morphol, 2004, 12(1): 44?48.

　　[6] Robertson GS, Crocker SJ, Nicholson DW, et al. Neuroprotection by the inhibition of apoptosis[J]. Brain Pathol, 2000, 10(2): 283?292.

　　[7] Ding H, Qiu S, Li S, et al. Expression, purification, crystallization of fragments from the C?terminal region of DFF45/ICAD[J]. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2003, 59(7): 1323?1326.

　　[8] Sharif?Askari E, Alam A, Rheaume E, et al. Direct cleavage of the human DNA fragmentation factor?45 by granzyme B induces caspase?cativated DNase release and DNA fragmentation[J]. EMBO J, 2001, 20(12): 3101?3113.

　　[9] 陶琳, 姚峰, 刘铭球，等. survivin基因表达与非小细胞肺癌发生发展的关系[J]. 癌症杂志, 2003, 6(4): 275?277.