宫颈癌组织高危HPV18 L1基因的克隆及序列分析
【摘要】 目的 克隆和分析人乳头瘤病毒18型晚期表达基因L1序列，为HPV感染的检测和基因工程疫苗研制提供基础。方法 采用PCR技术扩增了1例HPV18阳性宫颈腺癌患者癌组织中HPV18 L1基因，并对其进行了克隆及全序列分析。结果 本例宫颈癌临床标本HPV18 L1基因与GenBank收录的原型比较有12个碱基变异，推导其编码的氨基酸也发生了变化。结论 本例人宫颈癌HPV18 L1基因有一定的变异。
【关键词】 人乳头瘤病毒18型 L1基因 宫颈癌 克隆
0 引言
人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染是最常见的性传播疾病之一，至今，已发现100多型HPV，近半数可感染生殖道。其中，HPV 16、18、31、33、35和58 等型因与宫颈癌等恶性肿瘤的发生密切相关而归属高危群。
虽然HPV18是世界大部分地区宫颈癌患者中次于HPV16的第二位常见高危HPV[1，2]，但HPV18 较HPV16具有更强的恶性转化能力[3]。HPV感染的控制关键在于疫苗的发展。HPV晚期基因L1编码的病毒主要衣壳蛋白L1是病毒的重要抗原, 能刺激机体产生保护性抗体,故L1基因已被用于制备HPV疫苗[4]。由于HPV不能在体外经组织培养增殖，故而L1基因的克隆和表达对基因工程疫苗及诊断试剂的研制具有重要意义。本实验对来自陕西省的一例宫颈腺癌患者手术标本中的HPV18 L1基因进行了克隆及一级结构分析。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本DNA 选取我们用TDI?FP分型方法[1]鉴定出的一例HPV18阳性宫颈癌DNA。患者源自西安大学第二妇产科，42岁。经病理诊断为腺癌, 按FIGO分期为Ⅱa期。取材前未接受化疗和放疗。
1.1.2 菌株及主要试剂 DH5α大肠杆菌细胞株为第四军医大学全军基因诊断研究所保存，克隆载体连接试剂盒（pGEM??T Easy Vector System I，内有T4连接酶）和质粒提取试剂盒（Wizard?Plus Minipreps DNA Purification System）购自美国Promega公司，Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Hind Ⅲ及SacⅠ、DNA marker（DL2000）、异丙基硫代?β?D?半乳糖苷（IPTG）和5?溴?4?氯?3?吲哚?β?D?半乳糖苷（X?gal）、dNTP混合物购自大连宝生物公司，电泳凝胶片段回收试剂盒（CONCERTTM Rapid Gel Extraction System）购自美国GIBCO公司。蛋白酶K、RNA酶购自洛阳华美生物工程公司。引物和寡核苷酸探针由北京赛百盛公司合成。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增HPV18 L1基因 HPV18 L1 ORF全长引物依据GenBank设计。上游引物外设SacⅠ酶切位点和保护碱基CG，下游引物外设Hind Ⅲ酶切位点和保护碱基GC。该引物扩增的靶序列全长1707bp。PCR以从宫颈癌组织中提取的总DNA作为模板, 总体系25μl, 内含dNTP0.25mmol·L-1，引物各0.25μmol·L-1，MgCl2 2.5mmol·L-1，Taq酶2.5U。扩增条件：94℃变性5min后，进行35个循环：94℃ 40s, 56℃ 40s, 72℃ 2min, 末次循环后72℃延伸7min。
1.2.2 HPV18 L1基因的克隆和测序 将PCR产物经含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下看到1707bp 的L1扩增带，将含有相应片段的凝胶切下置入1.5ml Eppendorf 管中，分别严格参照电泳凝胶片段回收试剂盒及克隆载体连接试剂盒（pGEM??T Easy Vector System I）说明回收目的片段，并将目的片段与克隆载体pGEM?T Easy连接，构建HPV18 L1?pGEM?T 重组质粒，转化至CaCl2 法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中。在含有IPTG 和X?gal、氨苄青霉素阳性的LB琼脂平皿中蓝白筛选， 随机挑取3个白色单菌落扩大培养，按Wizard?Plus Minipreps DNA纯化试剂盒说明书步骤小量提取重组质粒，并进行酶Hind Ⅲ及SacⅠ双酶切鉴定。含有1707bp（L1）外源DNA片段的克隆为阳性克隆，送上海Sangon生物工程公司进行DNA序列测定，对测序结果进行分析。
2 结果
2.1 HPV18 L1基因的PCR扩增 从宫颈癌组织中提取的总DNA作为模板，用合成的 HPV18 L1引物进行PCR扩增，产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条清晰的扩增带，见图1，与预计的片段大小一致，为1 700bp左右。
2.2 重组质粒的构建及双酶切鉴定 目的片段回收后与线性克隆载体pGEM?T Easy连接，构建了HPV18 L1?pGEM?T重组质粒。将重组质粒经转化及HindⅢ和SacⅠ双酶切鉴定筛选出阳性克隆。酶切电泳结果如图2，可见重组质粒的插入片段与预计的1 707bp片段大小一致。
图1 HPV18 L1基因PCR产物的电泳分析（略）
图2 重组质粒HPV18 L1?pGEM?T 的双酶切鉴定（略）
2.3 重组质粒的序列测定和分析 将含重组质粒的阳性克隆经上海Sangon生物工程公司自动测序仪行正、反双向测定，拼接出L1完整序列，推导出相应的 L1蛋白质氨基酸序列。经blast同源性分析证实，克隆获得的HPV18 L1基因从起始密码子（ATG）到终止密码子（TAA）共1 707bp, 与GenBank收录的(收录号： X05015 )、由Cole等[5]报道的原型（prototype）比较，有12个碱基发生了变异，推导其蛋白质一级结构中可能有11个氨基酸发生改变，见表1。
3 讨论
近20年来对宫颈癌的病因及癌变机制的研究表明HPV是宫颈癌的主要致癌因素，近99%的宫颈癌组织中可检出HPV DNA。HPV16和HPV18是宫颈癌中最常见的高危型HPV，检出率达50%～90%[1, 2]。
体外研究发现，与HPV16相比，HPV18的恶性转化及使细胞永生化的能力更强[3]。据报道HPV18相关的宫颈癌癌前病变进程更快[6]。HPV18也是宫颈癌再发的独立危险因素[7]，且与宫颈腺癌显著相关[8]，HPV18相关宫颈癌早期诊断率低、预后差。因此，控制HPV18感染必将能减少HPV18感染相关肿瘤的病死率。
表1 宫颈腺癌样本中HPV18 L1基因突变分析（略）
到目前为止，对HPV感染所致的疾病尚无特异的抗病毒方法，其控制关键在于开发HPV疫苗。由于HPV不能在体外培养增殖，相关基因/蛋白的获得只能依赖基因工程重组及表达系统。HPV晚期基因L1编码的病毒主要衣壳蛋白L1是HPV的重要抗原，多种HPV重组L1蛋白能够自发折叠成病毒样颗粒（VLP），免疫机体后可刺激B淋巴细胞产生中和抗体，从而阻断HPV病毒感染，故而L1基因及蛋白已成为基因工程疫苗研制的重要靶向基因和蛋白[4]。
已知各型HPV有多种变种（variant）存在，即HPV基因呈高度多态性，这种多态性与地理位置有关,且因人群遗传背景差异而与疾病的相关关系不同[9]。本例HPV18 L1基因序列较GenBank收录的源自巴西的原型[5]比较有12个碱基发生突变，推导出的L1蛋白一级结构中的氨基酸11个发生了变化。L1基因变异导致的L1蛋白一级结构变化对蛋白功能，尤其蛋白免疫原性的影响尚需深入研究。在对HPV检测及疫苗研制时应考虑到基因变异可能的影响。
本实验从西安地区1例宫颈腺癌患者临床标本中成功地克隆到了HPV18型L1基因，该基因的成功克隆为其相应蛋白表达的后续工作奠定了基础，并对疫苗的进一步研制，以及开发具有诊断或预防功能的生物制剂都具有重大意义。
【】
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