反义硫代寡核苷酸增强细胞毒药物抗乳腺癌活性的体外研究
【摘要】 目的 研究以HER2 mRNA为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸（S?ODNs）HA6722单用及与紫杉醇合用时对HER?2过表达乳腺癌细胞株MDA?MB?453体外增殖的抑制作用。方法 选择HER2过表达的MDA?MB?453细胞与HER2低表达的MDA?MB?231细胞，MTT法观察HA6722单用及与紫杉醇合用时对两种肿瘤细胞增殖的影响；以末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果 HA6722及紫杉醇单用均可以剂量依赖方式抑制MDA?MB?453细胞的体外增殖， IC50值分别为47.6±7.9nmol·L?1(n=3, mean±s)和19.4±4.1nmol·L-1（n=3, mean±s）。加用低剂量的HA6722可增强紫杉醇对MDA?MB?453细胞的抑制作用，IC50值由合用前的19.4±4.1nmol·L-1降至13.6±5.2nmol·L-1（n=3，P＜0.05）。联合应用时，在IC50浓度下二者之间的联合指数（CI）为0.81±0.43(n=3)，其对MDA?MB?453细胞的相互作用表现为正性协同作用。结论 反义寡核苷酸HA6722与细胞毒药物紫杉醇合用对HER?2过表达乳腺癌细胞的体外增殖抑制具有协同作用。
【关键词】 反义 寡核苷酸 乳腺癌 HER2 mRNA 紫杉醇
0 引言
乳腺癌的化学近年来有了长足的进展，然而，经多线治疗仍复发转移的晚期患者的治疗，仍然十分棘手。探索包括生物靶向治疗在内的新疗法已成为近年研究的热点之一。
本研究室的前期研究表明，以HER2 mRNA为靶点的特异性硫代反义寡核苷酸，可以抑制HER2过表达乳腺癌细胞株增殖活性[1]。本研究拟对既往合成的反义寡核苷酸HA6722 单用或与紫杉醇联用时的抗乳腺癌活性进行研究，试图探索乳腺癌治疗新方法。
1 材料与方法
1.1 细胞系及培养
本研究采用的细胞株有：MDA?MB?453（HER2过表达），细胞培养所需的培养基为L15（Gibco, BRL），内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、不含CO2的培养箱中培养；MDA?MB?231（HER2低表达）的体外培养采用RPMI?1640（Gibco, BRL）培养基，内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养传代。当细胞生长至80%～85%融合时用0.25%胰蛋白酶消化，传代和收集细胞。
1.2 硫代反义寡核苷酸的合成及体外脂质体转染
反义寡核苷酸的靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸HA6722序列为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，其命名原则及合成见报道[2]。全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下：HA6722：5′CAG CAG CCG AGC CAG CCC GA3′
琼脂糖凝胶电泳结果表明反义寡核苷酸纯度符合要求。反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L?15或RPMI?1640培养基溶解浓度为50μmol·L-1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。
反义寡核苷酸体外脂质体转染按Invitrogen, Gibco BRL公司脂质体转染说明书所述方法进行。当培养细胞达到65%～70%融合时，进行转染，具体方法见文献[3]。
1.3 紫杉醇 由海南海药公司提供，30mg/支，临用时以无菌生理盐水稀释成所需浓度。
1.4 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测细胞活度 取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（Costar，USA），接种数量分别为：MDA?MB?453 5×104/孔、 MDA?MB?231 2×104孔。实验组及对照组细胞培养均设三个平行孔。待细胞生长至65%～70%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的HA6722转染细胞4～6h，再加入同摩尔浓度的紫杉醇，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液（0.5mg/ml）200μl，继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200μl DMSO, 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（OD值）。
1.5 细胞凋亡（apoptosis）检测 凋亡试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。以100nmol·L-1的HA6722及紫杉醇分别单独处理MDA?MB?453细胞12h，以及用50nmol·L-1的HA6722和相同浓度的紫杉醇先后作用MDA?MB?453乳腺癌细胞6h，收集经紫杉醇及HA6722单药或联合作用后的MDA?MB?453乳腺癌细胞，离心涂片，按操作说明检测细胞凋亡。细胞核内出现棕褐色沉淀为阳性，反之为阴性。凋亡指数（AI）=（凋亡细胞数/计数总细胞数）×100%。
1.6 反义药物及紫杉醇的疗效评价
对数生长期的MDA?MB?453细胞及MDA?MB?231细胞经系列浓度的HA6722及紫杉醇单用或联合作用后， MTT法测定OD值。紫杉醇单用时的系列终浓度为1、4、16、64、250及1 000nmol·L-1，而HA6722单用时的系列终浓度为12.8，32，80，200，500，1 250nmol·L-1；联合应用时二者以等摩尔浓度混合，系列浓度依次为6.4、16、40、100、250及625nmol·L-1，反应终体积为200μl。生存分数f按下述公式：f=ODtreat/ODcontrol(1)
联合方案的疗效评价按有关文献进行[4,5]，即以log(1/f?1)对log（药物浓度）作图，并行线性拟合，得曲线的x轴截距即为log（IC50），和直线斜率m，利用下述公式计算产生效应f时的单药及联合时的药物浓度：Dosef=DoseIC50[(1/f)?1]1/m (2)
由于联合方案采用的是固定摩尔浓度比,因此产生效应f的药物浓度可分解为联合药物的浓度（D）1和（D）2，对于产生任一效应f时的药物联合指数(combine index，CI)可以下列公式算出：
CI＝（D）1（Df）1＋（D）2（Df）2＋α（D）1（D）2（Df）1（Df）2(3)
式中（D）1和（D）2分别代表联合用药产生效应f时的浓度，而（Df）1和（Df）2分别代表药物单用时产生效应f时的浓度；根据推测两药不排斥或相互排斥的可能，α取值1或0；CI反映二药联合的相互作用，大于1表示拮抗，等于1表示相加，小于1表示协同。全部试验均进行3次以上重复。
1.7 统计学处理
采用SPSS10.0统计分析软件进行统计学处理，实验数据以±s表示，均数比较采用Student’s t检验和方差分析F检验（One Way Anova）。
2 结果
2.1 HA6722及紫杉醇单用时对两种乳腺癌细胞的抑制作用
在1、4、16、64、250及1 000nmol·L-1的终浓度下，紫杉醇对两种乳腺癌细胞的生长均显示剂量依赖性抑制作用，其抑制的IC50值分别为19.4±4.1nmol·L-1及23.6±5.7nmol·L-1，见图1A；而在12.8、32、80、200、500、1 250nmol·L-1的系列浓度作用下，HA6722对两种不同HER2表达水平的乳腺癌细胞的体外生长的影响迥然不同，对HER2过表达的MDA?MB?453细胞呈现明显的剂量依赖性抑制，而对HER2低表达的MDA?MB?231细胞则几乎没有抑制， IC50分别为47.6±7.9nmol·L-1和731.8±14.3nmol·L-1(n=3，P＜0.01，见图1B。
2.2 HA6722及紫杉醇乳剂合用对MDA?MB?453乳腺癌细胞的抑制作用
从上述初步结果可以看到，12.8nmol·L-1浓度的HA6722对MDA?MB?453细胞的抑制率只有4.7%，因而该浓度被作为非治疗浓度用于增强紫杉醇的药理作用研究，结果表明，由于该浓度HA6722的加入，紫杉醇对MDA?MB?453细胞的抑制作用增强，IC50值由19.4±4.1nmol·L-1降至13.6±5.2nmol·L-1（n= 3，P＜0.05）。
等摩尔浓度的HA6722与紫杉醇合用的研究表明，经6.4、16、40、100、250及625nmol·L-1的两种药物共同作用，MDA?MB?453细胞增殖呈现更为明显的抑制，见图2 A、B、C。在IC50浓度下的联合指数CI为0.85±0.16(n=3)，在研究涉及的全部药物浓度范围内，两种药物的联合指数波动在（0.85±0.11）～（0.87±0.27）之间，见图2D。
为了澄清HA6722与紫杉醇协同抗肿瘤作用是否具有细胞选择性，对HER2低表达的乳腺癌细胞株MDA?MB?231细胞也进行了同样的研究，结果表明，等摩尔浓度的二种药物合用对该细胞株的联合指数在所检测的药物浓度下，波动在（1.13±0.21）～（1.19±0.24）之间，见图3。
2.3 HA6722及紫杉醇乳剂合用对MDA?MB?453乳腺癌细胞凋亡的影响
经100nmol·L-1的HA6722及紫杉醇分别单独处理或以50nmol·L-1的HA6722和相同浓度的紫杉醇先后作用MDA?MB?453细胞后，TUNEL法对细胞凋亡的检测显示，HA6722与紫杉醇合用增强了细胞的凋亡作用（n=3，P＜0.05），见表1。
3 讨论
业已证明，原癌基因HER2过表达是一个独立的、不良的预后指标，将导致乳腺癌患者对某些化疗方案耐药[6]，生存期缩短[7]。
图1 紫杉醇及反义寡核苷酸HA6722单用时对两种乳腺癌细胞株，MDA?MB?453及MDA?MB?231细胞体外增殖的影响（略）
图3 等摩尔浓度的HA6722与紫杉醇合用时对MDA?MB?231联合指数随生存分数的变化曲线（略）
图2 紫杉醇和HA6722单用或联合时对MDA?MB?453细胞增殖的影响（略）
表1 HA6722与紫杉醇单用或联合应用对MDA?MB?453细胞凋亡的影响（略）
MDA?MB?453组*P<0.01，与HA6722+紫杉醇组相比； MDA?MB?231组**P＞0.05，与HA6722+紫杉醇组相比
紫杉醇是一种新型的抗微管集聚剂，是当前乳腺癌中疗效较高的药物之一。然而，由于绝大部分细胞毒药物存在剂量限制性毒副作用（DLTs），因而单用化疗药物不但无法治愈肿瘤，而且还会产生严重的毒副作用。事实上，一度被认为乳腺癌根治希望所在的大剂量化疗（HDCT）加干细胞支持疗法也并没有达到根治甚至是有效改善乳腺癌患者预后的目的[8]。
生物靶向治疗近年逐渐成为研究的焦点，以bcl?2等基因为靶点的反义药物G?3139已在体外及体内研究中均显示出明确的抗肿瘤作用，并可增强细胞毒药物的抗肿瘤效果[9，10]。如采用反义药物与细胞毒药物联合的办法，能在不影响抗肿瘤效果的前提下，降低细胞毒药物的用量，减少或避免毒性反应的发生，不失为一种两全的策略。本研究对反义药物HA6722与细胞毒药物紫杉醇对乳腺癌细胞体外增殖进行了相关研究。结果表明， 以低剂量（非治疗剂量）的HA6722与紫杉醇联合，可以引起紫杉醇抗MDA?MB?453细胞增殖活性的明显增强，IC50值由19.4±4.1nmol·L-1降至13.6±5.2nmol·L-1（n=3，P＜0.05）；而等摩尔浓度的上述两种药物联合，其对MDA?MB?453细胞的抗增殖作用较之两倍浓度的单药作用更强。在IC50浓度下两药的联合指数CI为0.85±0.16(n=3)，表明二者合用对HER2过表达的MDA?MB?453细胞的抑制作用是协同的。
本研究对两种药物合用时对乳腺癌细胞的凋亡过程进行了观察。结果表明，合用时MDA?MB?453细胞凋亡率明显强于二药之一的单独应用，与报告一致[11,12]。
本研究尚对另外一种HER2正常表达细胞MDA?MB?231细胞进行了研究，结果表明，HA6722和紫杉醇合用并未引起抗肿瘤活性的增强，进一步说明，这两种药物的协同抗肿瘤作用，是以乳腺癌细胞的HER2基因乃至受体过表达为前提，其详细机制有待于进一步研究。
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