VEGF?C和VEGF?R3在乳腺癌中的表达及与淋巴结转移的关系

              作者：汪蕊，陈睿，杨婉华，马湘一，王世宣，卢运萍，马 丁

【摘要】  目的 探讨VEGF?C及其受体VEGF?R3在乳腺导管癌中的表达及与淋巴结转移等临床病理指标的相关性。方法 采用免疫组化方法，检测60例乳腺导管癌及邻近正常组织中VEGF?C和VEGF?R3表达，并将表达结果与淋巴结转移情况及临床病理特征进行统计学分析。结果 乳腺导管癌中分别有78％和83％的VEGF?C、VEGF?R3阳性表达，而癌旁及正常乳腺组织散在性弱表达或无表达。VEGF?C在淋巴结转移组表达评分中位数为6，而在非淋巴结转移组评分中位数为1，差异有极显著性（P<0.01）。VEGF?R3在乳腺癌淋巴结转移组与淋巴结非转移组表达评分中位数分别为6.0、2.0，差异亦有极显著性（P<0.01）。结论 VEGF?C与VEGF?R3在乳腺癌的侵袭进展及区域淋巴结转移方面可能起重要作用。

【关键词】  VEGF?C； VEGF?R3； 乳腺导管癌； 淋巴结转移； 免疫组化

    Expression of VEGF?C and  VEGF?R3  in Breast Cancer and the Relation with Lymphatic Metastasis 

     Key words：VEGF?C； VEGF?R3； Breast cancer； Immunohistochemistry；  Lymphatic metastasis

    淋巴道转移是乳腺癌转移最主要的方式之一，且淋巴结的转移状态是决定预后的关键因素，但淋巴结转移的分子机制并未完全阐明。近年来人们发现血管内皮生长因子?C(Vascular Endothelial Growth Factor?C，VEGF?C)可与存在于淋巴管内皮的受体VEGF?R3结合，促进淋巴管增生及肿瘤的淋巴转移。为了研究VEGF?C和VEGF?R3在乳腺癌淋巴结转移中的作用，本实验采用免疫组化方法检测乳腺导管癌中VEGF?C、VEGF?R3的表达，探讨其与乳腺癌淋巴结转移及临床病理指标间的相关性。

    1  资料与方法

    1.1  一般资料  收集华中科技大学同济医学院附属同济乳腺外科2002～2004年间手术切除的乳腺浸润性导管癌标本共60例。所有患者术前均未接受放化疗，年龄28～76岁，平均48 岁，均行改良乳腺癌根治术及淋巴结清扫术。分期按1988年乳腺癌TNM国际分期标准，其中Ⅰ期10例，Ⅱ期32例，Ⅲ期17例，Ⅳ期1例。病理分级按Scarff?Bloom?Richardson分级法，Ⅰ级12例，Ⅱ级26例，Ⅲ级22例。

    1.2  研究方法及试剂  兔抗人VEGF?C、VEGF?R3多克隆抗体购自Santa Cruz 公司；免疫组化染色试剂盒及DAB试剂盒，购自北京中山生物有限公司。石蜡块制成4μm厚的组织切片，操作按试剂盒说明（SP法）进行。行微波抗原修复，一抗工作浓度均为1∶100。PBS缓冲液代替一抗以及正常乳腺组织作阴性对照。

    1.3  结果判定  染色后切片由二名有经验的病理医师阅片判读，细胞胞浆染色呈棕黄色颗粒为VEGF?C, VEGF?R3染色阳性细胞。采用半定量评分系统，依据阳性细胞的密度及面积的评分相乘结果进行判读。染色密度设为0～3分：0为无信号；1为弱信号；2为中等强度染色；3为强染色。染色面积也设为0～3分：0为无阳性细胞；1为阳性细胞数少于1/3；2为阳性细胞数在1/3～2/3范围间；3为阳性细胞数大于2/3。每张切片均在×200倍下，在癌灶及相邻正常组织内随机选取10个区域评分统计[1]。

    1.4  统计学分析  采用Mann?Whitney  U检验、Spearman等级相关分析，在SPSS11.5软件上进行。

    2  结果

    2.1  VEGF?C在乳腺组织中的表达  VEGF?C为胞浆着色，60例乳腺癌组织中47例有表达（78％）。VEGF?C在癌灶中的表达呈不同强度，淋巴结转移组28例评分中位数为6，非淋巴结转移组32例评分中位数为1，两者差异有极显著性（P<0.01）。除表达于癌巢外，VEGF?C在部分血管内皮细胞、平滑肌细胞的胞浆也有阳性表达，而良性乳腺组织中无表达或散在性弱表达。VEGF?C在邻近良性组织表达评分中位数为0.5，与在癌灶评分中位数3.85相比，差异有极显著性（P<0.01），见图1～3。

    2.2  VEGF?R3在乳腺组织中的表达  VEGF?R3为胞浆着色，有50例（83％）乳腺癌表达VEGF?R3，在淋巴管内皮细胞及一些血管内皮细胞也有阳性表达。乳腺癌的淋巴结转移组和非淋巴结转移组VEGF?R3评分中位数分别为6.0、2.0，差异有极显著性（P<0.01）。部分淋巴结转移组切片癌周淋巴管内皮细胞VEGF?R3表达强度高于癌灶，见图4。

    2.3  VEGF?C、VEGF?R3与其他临床指标、病理特征之间的关系以及二者间的相关性  VEGF?C和VEGF?R3的表达均与TNM分期有关，且Ⅲ～Ⅳ期患者的评分显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者，VEGF?C和VEGF?R3的P值分别为0.024、0.041，均有统计学差异。二者与年龄、病理分级、ER、PR均无明显关系。VEGF?C与VEGFR?3表达均阳性42例，VEGF?C阳性VEGF?R3阴性5例，相关分析表明两者有明显相关性(P<0.01)，而其他指标间未见明显相关，见表1、2。表1  VEGF?C[VEGF?R3表达与临床病理特征的关系

    3  讨论

    现今已有愈来愈多的研究聚焦于淋巴管的形成和转移的分子机制，其中血管内皮生长因子C（VEGF?C）与其受体VEGF?R3是研究的热点之一。VEGF?C是血管内皮生长因子（VEGF）家族的新成员，它是一种针对淋巴管内皮细胞的有丝分裂原,双重转基因小鼠实验证明，VEGF?C能诱导淋巴管生成，并介导肿瘤细胞播散和区域淋巴结转移[2]。VEGF?C和受体VEGF?R3结合后，通过MEK/ERK和PI3激酶/Akt途径引起淋巴管内皮增生，并可能改变原有的和新生的淋巴管内皮的通透性以及肿瘤细胞和胞外基质的粘附性；同时淋巴管数目增多，使瘤细胞接触淋巴管的机会增多，也促进肿瘤的转移[3，4]。近年来发现VEGF?C及VEGF?R3与头颈部肿瘤、胃癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌等恶性肿瘤的淋巴管侵犯及淋巴结转移有关,并且是独立的预后不良因素[4，5]。

    我们的研究发现，VEGF?C、VEGF?R3分别在78％、83％的乳腺导管癌中表达，且呈不同的强度，淋巴结转移组显著性强于无淋巴结转移组，而在癌灶邻近的乳腺正常组织中表达明显减弱。这提示在从正常组织向癌的转变过程中，VEGF?C和VEGF?R3表达是上调的，并与淋巴结的区域转移密切相关。两者表达水平的上调可能在肿瘤淋巴管的生成及淋巴转移过程中起到了重要的作用。VEGF?R3存在于恶性乳腺癌细胞内，这与最近的研究发现VEGF?R3存在于肿瘤细胞株及实体肿瘤相一致[6、7]。这也使我们置疑VEGF?R3作为淋巴管标记物的特异性[8]。同时恶性肿瘤上皮细胞自身表达VEGF?R3并与VEGF?C显著相关（P<0.01），提示VEGF?C可能具有潜在的自分泌及旁分泌调节方式，VEGF?C可能在促进肿瘤细胞的增殖及随后的侵袭方面都发挥重要的作用。研究中我们还观察到，VEGF?R3的强阳性染色多集中于淋巴结转移组癌巢的边缘淋巴管内皮细胞，同时该处周边的淋巴管数目也较淋巴结非转移组多，提示可能是VEGF?R3在淋巴结转移组尤其是癌灶边缘受到更高浓度的VEGF?C的上调表达并一步通过诱生周围的淋巴管以促进转移。目前VEGF?R3上调表达的机制仍不清楚，而肿瘤相关淋巴管的密度也一直是关注点。多数学者认为肿瘤周边的淋巴管密度较正常是增高的，且高密度的淋巴管与淋巴结转移密切相关，是独立的预后高危因素[9] ，而Trojan等[10] 却发现肿瘤周边淋巴管密度对比正常组织是减少的。我们观察的结果与前者相符。

    总之， 我们的研究表明VEGF?C和VEGF?R3的高表达水平与乳腺癌的淋巴结转移显著相关， VEGF?C和VEGF?R3在乳腺癌组织中表达升高可能是肿瘤生长及区域淋巴结转移的重要原因之一。 对VEGF?C/VEGF?R3信号通路的抑制不仅是抗肿瘤自身而且是抗肿瘤淋巴管生成及转移的一种新方法。 VEGF?C及VEGF?R3可能成为抗肿瘤研究和的新靶点， 以期阻断恶性肿瘤的侵袭和转移。

【】
  ［1］ Jennbacken K,Vallbo C,Wang W, et al. Expression of vascular endothelial growth factor C (VEGF?C) and VEGF receptor?3 in human prostate cancer is associated with regional lymph node metastasis[J]. Prostate，2005，65(2):110?6.

［２］ Jeltsch M, Kaipainen A, Joukov, et al. Hyperplasia of lymphatic vessels in VEGF?C transgenic mice[J]. Science, 1997,276(30):1423?1425.

［３］ Muller A,Homey B,Soto H, et al. Involvement of chemokine receptor in breast cancer metastasis[J]. Nature， 2001，410(6824):50?56.

［４］ Kriehuber E, Breiteneder?Geleff S,Groeger M, et al. Isolation and characterization of dermallymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages[J]. J Exp Med， 2001，194(6):797?808.

［５］ Yonemura Y, Fushida S, Bando E, et al. Lymphangiogenesis and the vascular endothelial growth factor receptor(vegfr)?3 in gastric cancer[J]. Eur J Cancer, 2002, 37(7):918?923.

［６］ Tanno S,Ohsaki Y,Nakanishi K, et al. Human small cell lung cancer cells express functional VEGF receptors, VEGFR?2 and VEGFR?3[J]. Lung Cancer， 2004，46(1):11?19.

［７］ Chen H,Ye D,Xie X, et al. VEGF,VEGFRs expressionsand activated STATs in ovarian epithelial carcinoma[J]. Gynecol Oncol， 2004，94(3):630?635.

［８］ Longatto Filho A, Martins A,Costa SM, et al. FC.VEGFR?3 expression in breast cancer tissue is not restricted to lymphatic vessels[J]. Pathol Res Pract， 2005，201(2):93?99．

［９］ Yasushi Nakamura, Hironao Yasuoka, Masahiko Tsujimoto,et al. Flt?4?positive vessel density correlates with vascular endothelial growth factor?D expression, nodal status, and prognosis in breast cancer[J]. Clin Cancer Res， 2003，9(14):5313?5317.

［１０］Trojan L,Michel MS,Rensch F, et al. Lymph and blood vessel architecture in benign and malignant prostatic tissue: Lack of lymphangiogenesis in prostate carcinoma assessed with novel lymphatic marker lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor(LYVE?1)[J]. J Urol， 2004， 172(1):103?107.