人乳腺癌裸鼠移植瘤的体外抗生素诱导基因治疗

          作者：曾赵军，胡维新，李子博，罗赛群

【摘要】  目的 探讨Tet调控下体外抗生素诱导基因人乳腺癌裸鼠移植瘤的可行性。方法 构建人乳腺癌BALB/C裸鼠移植瘤模型, 制备有感染活性的重组逆转录病毒RevTRE/HSVtk与RevTet?On。 观察体外强力霉素（Dox）诱导, 丙氧鸟苷（GCV）和逆转录病毒作用后移植瘤生长的变化及组织病理改变, 分析其对乳腺癌裸鼠移植瘤的调控性治疗作用。结果 乳腺癌裸鼠治疗后，肿瘤体积明显减小，生长受抑，生存周期延长, 组间比较有显著性差异（P<0.05）。瘤体HE染色显示治疗组肿瘤局部有炎性细胞浸润和强嗜酸性细胞。RT?PCR结果显示Dox诱导后瘤体组织HSVtk表达较明显。结论 通过逆转录病毒介导Tet调控，可以在体外抗生素Dox诱导下对人乳腺癌裸鼠移植瘤模型进行基因治疗，杀伤肿瘤细胞。

【关键词】  乳腺癌；基因治疗；裸鼠；逆转录病毒；基因调控

基金项目：美国中华医学会（CMB）基金资助项目（# 99?698）

    Key words：Breast cancer；Gene Therapy；BALB/C mice；Retrovirus；Antibiotic

    自杀基因治疗是近年来肿瘤治疗研究的热点之一。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)在体细胞内能将无毒的药物前体GCV代谢为有毒物质，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而清除肿瘤［1］。本实验用含有调控因子Tet?On和HSVtk基因的重组逆转录病毒与底物GCV处理后,在体外强力霉素作用下观察对人乳腺癌BALB/C裸鼠移植瘤模型肿瘤生长、瘤体大小以及肿瘤组织病等改变,分析肿瘤组织内HSVtk基因表达的变化。以探讨在体外抗生素诱导下, 自杀基因对乳腺癌细胞株MCF?7移植的乳腺癌裸鼠的体外调控性治疗作用。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞与动物  人乳腺癌细胞株MCF?7、PA317、NIH3T3来自中南大学湘雅医学院细胞中心。年龄4周的雌性BALB/c裸鼠（nu?/ nu?）购于医学院上海实验动物中心。

    1.1.2  主要试剂和质粒  质粒载体pRevTRE、pRevTet?On购自美国Clontech公司，质粒pGEM7Z?tk由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所曹亚教授惠赠。pRevTRE/HSVtk由本中心构建［2］，含有四环素反应元件（TRE）和自杀基因HSVtk。限制性内切酶购自Roche公司和Promega公司。G418、潮霉素、DMEM、0.25%胰蛋白酶、RNA?TRIzol 试剂盒均购自Gibco BRL公司。GCV、Dox购自美国Sigma公司。其余试剂购自Sigma公司。

    1.2  逆转录病毒的制备、纯化与滴度测定

    通过改进的“微乒乓感染法”将质粒逆转录病毒载体导入包装细胞PA317中，以潮霉素B或 G418筛选克隆细胞，浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒［3］。得到病毒后纯化并测定其滴度。

    1.3  BALB/c裸鼠移植瘤模型的建立、分组和干预方法

    模型的构建：取对数生长期的MCF?7细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用PBS洗2遍，离心1 000r/min 4min，无血清的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数使细胞密度达2×106/ml，以0.2ml细胞悬液注射接种于BALB/c裸鼠左侧近前腋处皮下并作好标记。细胞接种后，观测裸鼠生长状况。

    动物分组和干预：待裸鼠皮下肿瘤长至0.7～0.8cm后，按随机数字表法将裸鼠随机分为4组，即培养基DMEM组、GCV+病毒组、GCV+Dox组、Dox+GCV+病毒治疗组，每组8只，苦味酸标记。 GCV+病毒组、Dox+GCV+病毒治疗组荷瘤裸鼠皮下肿瘤内给予注射病毒悬液，病毒滴度为1×106 CFU/ml，每周2次，连续2周。同时注射病毒悬液第2周开始GCV+Dox组、Dox+GCV+病毒治疗组荷瘤裸鼠皮下肿瘤内给予注射Dox 0.1ml（100mg/kg），连续7d。DMEM组给予腹腔注射DMEM培养基0.2ml，GCV+病毒组、GCV+Dox组、Dox+GCV+病毒治疗组均给予腹腔注射GCV（100mg/kg）各0.2ml，每天上下午各1次，连续14d。治疗前后每隔3d均用游标卡尺测量肿瘤瘤体长径b和短径a，监测荷瘤裸鼠体重及生长状况。肿瘤体积按V=π (a2×b) /2 (mm3)公式。同时记录下荷瘤裸鼠的生存时间。

    1.4  BALB/c裸鼠移植瘤组织病理形态学检测

    治疗结束后BALB/c裸鼠以2% 戊巴比妥钠（20mg/kg）腹腔内注射麻醉。解剖BALB/c裸鼠，观察肿瘤与周围组织粘连、浸润生长及淋巴转移情况。取出肿瘤组织，除去结缔组织，在无菌条件下称量每只BALB/c裸鼠新鲜肿瘤瘤体湿重并拍照。计算肿瘤生长抑制率：（1-不同处理组瘤重/对照组瘤重）×100%。然后肿瘤组织用无菌生理盐水快速冲洗2～3次，留取部分肿瘤迅速投入液氮中保存作RT?PCR分析HSVtk基因表达用；余下部分肿瘤从最大面切开肿瘤，肉眼观察肿瘤颜色、有无出血、坏死及与周围组织粘连等改变。肿瘤组织以10%多聚甲醛固定24h，经70%、80%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明2次，每次20min，56℃～60℃ 浸蜡1h，石蜡包埋。以5μm厚度行组织切片，HE染色后，普通显微镜下观察并拍照。

    1.5  RT?PCR检测BALB/c裸鼠移植瘤组织HSVtk基因的表达

    从液氮中取出移植瘤组织，剪碎，加入TRIzol溶液研磨。按RNA?TRIzol 试剂盒提取细胞总RNA, 在0.5ml Eppendorf管中加入RNasin(10U/μl) 1 μl，Oligo(dT)15引物（0.5g/L）1μl，总RNA 1μg，dNTP (10 mmol/L) 2μl，5×逆转录缓冲液10 μl，AMV逆转录酶 (2.5×107u/L) 1 μl，补加无RNA酶的DEPC水至总反应容积为50μl，混匀，42℃反应1h，94℃ 5min终止反应，冰浴冷却5min，-20℃ 保存。PCR反应在0.5ml Eppendorf管中依次加入灭菌水32μl，10×PCR缓冲液5μl，MgCl2 (25mmol/L) 4μl，dNTP（10mmol/L）1μl，3′ 和5′端引物（2.5μmol/L） 各2μl，TK引物为（上游引物：5′?GGCATGCCTTATGCCGTGACCGAC?3，下游引物5′?CCAGGTCGCATATCGTCGGTATGG?3′）扩增HSVtk基因片段；逆转录产物5μl，Taq DNA聚合酶（5 000 u/L）1μl，总反应容积为50μl混匀。覆盖石蜡油，稍加离心，94℃变性2min。设置反应程序：94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸50s共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应产物5μl加2μl载样缓冲液，以1×TAE为电泳缓冲液，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳约1h (电压80V)。 PCR产物应为420bp，以β?actin（PCR产物为280bp）为对照，反应体系同上。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶用图像分析仪进行分析。

    1.6  统计学分析

    采用t检验和方差分析（SPSS10.0统计软件包），P＜0.05有显著性差异。

    2  结果

    2.1  Dox诱导干预后对裸鼠移植瘤生长的影响

    Dox+GCV+病毒组裸鼠治疗后35d，与对照组相比较，肿瘤体积明显减小，生长受到明显抑制，组间比较有显著性差异（P<0.05）；而对照组DMEM、GCV+病毒、GCV+Dox干预处理35d后，瘤体积变化进行组间比较无显著性差异（P>0.05，图略）。Dox+GCV+病毒组肿瘤生长抑制率为89%，而GCV+Dox组和GCV+病毒组的肿瘤生长抑制率分别为47%、56.3%，Dox+GCV+病毒组（治疗组）肿瘤生长抑制率显著大于其他组（P<0.05），见表1。表1  各组BALB/c裸鼠移植瘤治疗结束后 Dox+GCV+病毒组肿瘤湿重与各对照组相比较，差异有显著性*（P<0.05）；DMEM组BALB/c裸鼠肿瘤湿重与各组相比较，差异有显著性*（P<0.05）；GCV+Dox组与GCV+病毒组裸鼠肿瘤湿重相比较，差异无显著性（P=0.516>0.05）

    2.2  裸鼠移植瘤组织病理形态学观察

    解剖BALB/c裸鼠，观察发现裸鼠移植瘤为实体瘤，多呈球形或结节状，有完整包膜，有的与周围组织有粘连，有新生血管生成。HE染色镜下观察发现：Dox+GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤的组织切片中有较多的散在小片状坏死区，细胞形态结构模糊，胞核裂解、消失。肿瘤局部有炎性细胞浸润和强嗜酸性细胞。对照组肿瘤细胞则排列紧密，多呈巢状，间质纤维可见。瘤细胞较大，形态多样。核深染, 胞浆丰富。肿瘤细胞生长活跃并可见核分裂相和瘤巨细胞。

    2.3  RT?PCR检测HSVtk基因的表达

    RT?PCR获得约420bp的DNA片段，与预期片段大小一致。RT?PCR结果显示强力霉素诱导后的Dox+GCV+病毒治疗组裸鼠移植瘤组织内HSVtk表达较明显，GCV+病毒组有微弱表达，而DMEM组、GCV+Dox组肿瘤组织内没有检测到HSVtk基因的表达，见图1。

    3  讨论

    有效地靶向转录或使目的基因受转录调控元件的精确调控是基因治疗领域的研究热点之一。假如能利用抗生素在体外调节控制导入的外源基因的表达将有助于控制基因治疗中毒副作用的发生，使治疗更安全有效。Gossen等［4］提出的Tet调控系统就是利用大肠杆菌抗四环素操纵子(tet operon)的阻遏与去阻遏作用来调控基因表达，使目的基因表达受到四环素的精确调控。其中Tet激活系统（Tet?On）是突变的Tet阻遏蛋白与VP16的激活域融合表达rtTA，在强力霉素存在时，rtTA与TetOp结合启动子，可以激活或抑制靶向转录［4］。作者通过构建有调控因子Tet?On基因及调控元件TRE和胸苷激酶基因HSVtk的逆转录病毒, 转入乳腺癌肿瘤细胞中，使得BALB/c裸鼠移植瘤能受到外源诱导剂强力霉素Dox的诱导控制，使自杀基因HSVtk转录与表达与Tet?On系统的开启相一致，并可激活前药丙氧鸟苷GCV，转变为有毒物质,从而在裸鼠体内发挥杀瘤作用。实验中Dox+GCV+病毒治疗组裸鼠治疗后35d，与对照组相比较，瘤组织中外源HSVtk基因的表达明显，肿瘤体积减小，生长受到了明显抑制。进一步说明强力霉素Dox诱导开启了经逆转录病毒感染进入裸鼠移植瘤组织的Tet?On系统，并激活了体内外源HSVtk基因的表达，使乳腺癌细胞死亡。该系统的建立对于今后在临床基因治疗中体外给予抗生素（如强力霉素等）干预以达到治疗和调节体内恶性肿瘤的生长奠定了良好的实验基础。

【】
  ［1］ Finocchiaro LM, Bumaschny VF, Karara AL, et al. Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir system in multicellular tumor spheroids［J］. Cancer Gene Ther, 2004, 11(5):333?345.

［2］ Ingram N, Porter CD. Transcriptional targeting of acute hypoxia in the tumour stroma is a novel and viable strategy for cancer gene therapy［J］. Gene Ther，2005，12 (13): 1058?1069.

［3］ 曾赵军，胡维新，罗赛群，等. 重组逆转录病毒介导的HSVtk基因表达及提高逆转录病毒滴度的初步研究［J］. 中华实验和临床病毒学杂志，2004，18（4）：332?336.

［4］ Gossen M, Freundlied S, Bender G, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells［J］. Science, 1995, 268(5218): 1766?1769.