侵袭性垂体腺瘤中CD44与Ki?67表达的相关性

           作者：段波，赵洪洋，李新建，胡学斌，涂汉军

【摘要】  目的 探讨细胞粘附分子CD44、细胞增值核抗原Ki?67在侵袭性垂体腺瘤中的表达及意义并探讨二者之间的关系。方法 用免疫组化法检测CD44s、CD44v5、Ki?67在20例侵袭性垂体腺瘤和18例非侵袭性垂体腺瘤中的表达。结果 CD44s 和Ki?67在侵袭性垂体腺瘤组中表达高于非侵袭性垂体腺瘤组(P<0.01)，且二者在垂体腺瘤中的表达呈正相关。CD44v5在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤中表达无明显差异(P>0.05)。结论 CD44s和Ki?67与垂体腺瘤的侵袭性生长行为有关，二者协同作用，在侵袭性垂体腺瘤的发生、中起重要作用，可作为侵袭性垂体腺瘤诊断和判断预后的重要生物学指标。

【关键词】  侵袭性垂体腺瘤；非侵袭性垂体腺瘤；CD44s；CD44v5；Ki?67

    Expression and Relationship between CD44 and Ki?67 in Invasive Pituitary Adenoma

     Key words：Invasive pituitary adenoma；Non?invasive pituitary adenoma；CD44s；CD44v5；Ki?67

    CD44是一种细胞表面糖蛋白，参与细胞与细胞、细胞与细胞外基质（ECM）之间的特异性粘附，在肿瘤细胞的侵袭性生长和转移过程中发挥重要作用。Ki?67是一种与细胞增殖相关的核抗原，是近年来研究较为广泛的细胞增生的标记。细胞的增殖与肿瘤的发生、浸润、种植与转移过程相关，评价细胞的增殖状态对研究肿瘤的生物学行为，判断其危害性具有重要意义。

    本文对侵袭性垂体腺瘤中CD44及Ki?67的表达进行研究，以探讨这两种蛋白在侵袭性垂体腺瘤生长中的意义及二者之间的相关性。

    1  材料与方法

    1.1  材料  标本取自2001～2005年华中科技大学同济医学院附属协和神经外科手术切除并经病证实的垂体腺瘤标本38例。男21例，女17例。年龄23～71岁，平均年龄39岁。依据内分泌学检查：非功能腺瘤23例，生长激素腺瘤9例，泌乳素腺瘤5例，ACTH腺瘤1例。所有标本均有完整临床资料并依据Wilson改良Hardy分类系统分级分期标准分组［1］：侵袭性垂体腺瘤组20例，非侵袭性垂体腺瘤组18例。

    1.2  试剂和方法

    1.2.1  试剂来源  CD44s、CD44v5、Ki?67单克隆抗体及即用型链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶（SP）免疫组化染色超敏试剂盒，DAB显色试剂盒均购自福建迈新生物工程技术公司,均为工作液。

    1.2.2  免疫组化染色  标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，5μm厚连续切片，常规脱蜡和水化后，分别用过氧化氢酶和动物血清处理10min。与CD44s、CD44v5、Ki?67单克隆抗体4℃过夜。二抗温育20min，DAB显色5min，苏木素衬染，各步骤间均以PBS洗片。用已知阳性片作阳性对照,以PBS代替一抗作空白对照, HE染色作组织学参照。

    1.2.3  结果判断  CD44s、CD44v5阳性细胞均定位于细胞膜，表现为细胞膜呈黄色或棕黄色，部分细胞浆染色。每张切片均在×400显微镜下观察，连续观察5个高倍视野，各记数100个细胞取其平均值，以百分数表示，阳性细胞数>30%定为强阳性，10%～30%定为弱阳性，<10%定为阴性。Ki?67阳性着色表现为细胞核染成棕黄色或棕褐色，背景不着色。每张切片均在×400显微镜下观察，连续观察5个高倍视野，取阳性细胞数均值并增殖细胞标记指数LI＝（阳性细胞数/所计细胞总数）×100，以LI为1.5%为阈［2］，<1.5%（-），1.5%～3 %（+），>3%（++）。

    1.2.4  统计学处理  采用卡方检验及Pearson相关检验，P<0.05为统计学有显著意义。

    2  结果

    2.1  CD44s、CD44v5在垂体腺瘤中的表达

    侵袭性垂体腺瘤中，CD44s阳性细胞染色较深，阳性细胞数多且集中。而非侵袭性垂体腺瘤中阳性细胞染色浅，阳性细胞数少且分散，见图1。CD44v5  在各组中阳性细胞数均较少，染色浅，见图2。侵袭性垂体腺瘤组中CD44s阳性15例（75%），CD44v5阳性7例（35%）。非侵袭性垂体腺瘤组CD44s阳性5例（27.8%），CD44v5阳性4例（22.2%）。两组之间CD44s蛋白表达具有显著性差异（χ2=8.474，P<0.01），CD44v5蛋白表达无显著性差异（χ2=2.991，P>0.05），见表1。

    2.2  Ki?67抗原在垂体腺瘤中的表达

    Ki?67抗原阳性细胞定位于细胞核，表现为细胞核呈黄色或棕黄色，见图3。Ki?67抗原在垂体腺瘤中的表达见表1，两组之间具有显著性差异（χ2=8.657，P<0.01）。表1  CD44s、CD44v5、Ki?67在垂体腺瘤中的表达

    2.3  CD44s和Ki67在垂体腺瘤中表达的相关性

    CD44s蛋白阳性表达的标本中，有17例Ki?67阳性，CD44s蛋白阴性表达的标本中，有11例Ki?67阴性，CD44s强阳性表达的标本中Ki?67也多呈强阳性表达（9/11，81.8%），二者具有显著正相关（r＝0.473，P<0.005）。表2  CD44s、Ki?67在垂体腺瘤中表达的相关性

    3  讨论

    垂体腺瘤是颅内常见的一种良性肿瘤，因部分肿瘤生长突破包膜，侵袭邻近组织，有学者将这部分肿瘤称为侵袭性垂体腺瘤，其危害性主要在于对周围结构的侵蚀，手术不易全切，术后易复发。侵袭性垂体腺瘤主要根据临床及手术中所见判断，尚缺乏统一有效的诊断标准。本研究采用的是目前比较公认的Wilson改良Hardy分类系统分级分期标准，3级和4级是侵袭性垂体瘤［1］。

    肿瘤侵袭性生长及转移的过程中，肿瘤细胞首先需从肿瘤基团分离并与细胞外基质（ECM）粘附，在这一过程中，细胞粘附分子发挥着重要的作用［3］。CD44作为粘附分子家族中的一员，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的粘附，是细胞外基质成分透明质酸盐的主要受体。根据CD44蛋白外显子表达方式的不同分为标准型CD44（CD44s）和变异型CD44（CD44v）两种类型［4］，对于它们在肿瘤中所起作用有不同的观点。熊正文等［5］检测正常脑组织及颅内转移瘤和胶质母细胞瘤中CD44s和CD44v6蛋白的表达，发现正常脑组织中CD44s和CD44v6均为阴性，而CD44s在脑胶质母细胞瘤和颅内转移瘤中呈高表达，CD44v6只在颅内转移瘤中表达，在脑胶质母细胞瘤中不表达。由此认为CD44s与肿瘤的侵袭行为有关，而CD44v6则与肿瘤的转移相关。本试验研究结果也表明，CD44s在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤中的表达具有显著性差异（P<0.05），CD44v5在两组中的表达率均较低，无显著性差异，说明CD44s与垂体腺瘤的侵袭性生长行为有关。

    肿瘤的侵袭性生长还与肿瘤细胞的增殖活性有关，生长快的肿瘤具有比较强的侵袭性。细胞增殖核抗原Ki?67标记指数能准确、可靠的评价细胞的增殖活性，是一种较理想、独立的生物标志物。Mastronardi等［6］研究垂体腺瘤中Ki?67抗原的表达，认为在侵袭性垂体腺瘤中的Ki?67标记指数明显高于非侵袭性垂体腺瘤，并提出将Ki?67标记指数3.5%作为区分侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤的标准。Ekramullah等［7］也认为高增殖能力的垂体腺瘤侵袭力强。我们分析38例垂体腺瘤中Ki?67抗原的表达，也得出同样的结论：Ki?67抗原在侵袭性垂体腺瘤中的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤，且有显著性差异，说明Ki?67抗原标记可以反应垂体腺瘤的生长速度及侵袭性，可以作为垂体腺瘤诊断及判断预后的有价值的标记物［8］。

    肿瘤细胞粘附性和细胞增殖活性与肿瘤侵袭性生长之间是否具有协同作用，尚未见报道。本试验中，CD44s和Ki?67阳性表达具有显著正相关（r＝0.473，P<0.005）。说明CD44s和Ki?67在垂体腺瘤的侵袭性生长中可能起协同作用，增值能力高的肿瘤具有较强的粘附性和侵袭性。

    综上所述，我们认为垂体腺瘤侵袭性生长与肿瘤细胞的粘附及增值活性密切相关。因此，降低肿瘤细胞的粘附及增值活性也可降低肿瘤的侵袭性。同时，联合检测Ki?67和CD44s则对提高侵袭性垂体腺瘤诊断的准确性及判断预后具有重要意义。

【文献】
  ［1］ Thapar K, Laws ER Jr. Growth homone?secreting pituitary tumors: operative management［A］. In: Krisht AF, Tindall GT, ed.Pituitary disorders comprehensive management ［M］.Baltimore,Maryland, USA: Lippincott Williams & Wilkins.1999. 243?258.

［2］ 熊文浩, 李善泉, 周文雄，等. 垂体腺瘤p16蛋白及Ki ? 67表达的研究［J］. 上海第二医科大学学报，2001,21(3)：226?228.

［3］ Nagano O, Saya H. Mechanism and biological significance of CD44 cleavage［J］. Cancer Sci, 2004,95(12):930?935.

［4］ Alaniz L, Cabrera PV, Blanco G. Interaction of CD44 with different forms of hyaluronic acid. Its role in adhesion and migration of tumor cells［J］. Cell Commun Adhes, 2002, 9(3): 117?130.

［5］ 熊正文，冯骥良，苏红，等. CD44s、CD44v6在颅内转移瘤和胶质母细胞瘤中的表达研究［J］. 实用医学杂志，2005，21（1）：29?31.

［6］ Mastronardi L, Guiducci A, Spexa C，et al. Ki?67 labelling index and invasiveness among anterior pituitary adenomas:analysis of 103 cases using the MI B?1 monoclonal antibody［J］. J Gin Pathol, 1999，52(2): 107?111.

［7］ Ekramullah SM, Saitoh Y, Arita N, et al. The correlation of Ki?67 staining indices with tumor doubling times in regrowing non?function?ing pituitary adenoma［J］.Acta Neurochir(Wien), 1996, 138(12): 1449?1445.

［8］ Shibuya M，Saito F, Miwa T, et al. H istochem ical study of pituitary adenom as with Ki?67 and anti?DNA polym erase a m onoclonal anti bodies, bromodeoxyurindine labeling, and nucleolar organizer region counts［J］. Acta Neuropatho1, 1992, 84(5): 178?183.