转化生长因子βⅡ型受体基因突变在大肠腺瘤癌变过程中的作用

          作者：王朝晖，张雪梅，姜春萌，应力

【摘要】  目的 探讨转化生长因子β（TGF?β）Ⅱ型受体基因突变、微卫星不稳定性（MSI）在大肠腺瘤癌变过程中的作用。方法 选用BAT?26微卫星位点应用PCR?SSCP银染方法鉴定大肠腺瘤及大肠癌组织MSI状态，并检测TGF?βⅡ型受体突变热点cDNA709?718在大肠腺瘤、大肠癌中的突变情况及其与大肠癌临床病理特征的关系。结果 本实验选取的60例大肠癌中TGF?βⅡ型受体的突变率为26.7%（16/60），42例大肠腺瘤的突变率为11.9%（5/42），且均发生在伴中重度不典型增生的晚期腺瘤中。本组88.8% MSI大肠癌存在TGF?βⅡ型受体基因突变。TGF?βⅡ型受体突变与大肠癌临床病理特征间有密切关系，其多位于右半结肠，多发生在伴MSI的大肠癌，多为分化不良型腺癌，Duke’s A、B期患者比例显著高于Duke’s C、D期（P＜0.05）。结论 转化生长因子βⅡ型受体基因突变致细胞失去对TGF?β的生长抑制反应而发生肿瘤可能在大肠腺瘤癌变过程起着重要作用，其可能是MSI大肠癌发生的分子机制，且与大肠癌临床病理特征间有密切关系。

【关键词】  转化生长因子β；受体；突变；大肠腺瘤；大肠癌

    Mutation Analysis of Transforming Growth Factor β Ⅱ Receptor Gene in Colorectal Adenoma Carcinogenesis

      Key words：Transforming growth factorβ；Receptor；Mutation；Colorectal neoplasm；Adenoma

    转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF?β）是人体多种上皮组织细胞的负生长调控因子，但研究发现，不同的细胞株对TGF?β的反应不同，并且某些肿瘤细胞存在着逃逸TGF?β负调控作用的现象。因此，细胞对TGF?β负调控作用的逃逸可能是癌变过程中的一个重要环节。进一步研究表明，肿瘤细胞的这一特性可能与其表面的TGF?βⅡ型受体（TGF?β receptorⅡ，TGF?βRⅡ）基因突变有关，且在大肠腺瘤癌变过程中起着重要作用，本研究应用PCR?SSCP（single stranded conformation polymorphism，SSCP）方法对大肠腺瘤及大肠癌组织的微卫星不稳定性及TGF?βRⅡ基因的突变热点cDNA709?718进行了检测。

    1  材料与方法

    1.1  研究对象

    随机收集1999～2003年我院外科手术切除和纤维结肠镜活检标本，其中大肠癌60例，患者年龄52～72岁，男36例，女24例；大肠腺瘤42例，患者年龄18～70岁，男26例，女16例。所有标本均经病理证实。正常对照取自手术癌旁正常组织或正常活检粘膜，共16例。所有标本均于离体后半小时内液氮中速冻，然后置于-80℃冰箱中保存待测。

    1.2  组织DNA提取

    以上标本按常规酚?氯仿抽提方法提取组织DNA，溶于0.1mol/L TE溶液中，测定其浓度后-20℃保存待用。

    1.3  大肠腺瘤及大肠癌组织TGF?β RⅡ基因突变的检测

    1.3.1  组织DNA的PCR扩增  目前研究表明，TGF?β RⅡ基因的突变热点为cDNA709?718，因而本研究将对此位点进行检测。TGF?βRⅡcDNA709?718位点的PCR扩增引物由上海华美生物公司合成，其序列为：

    Forward 5′?AGATGCTGCTTCTCCAAAGTCT?3′

    Reverse 5′?TTGCACTCATCAGAGCTACAGG?3′

    PCR扩增条件为94℃30s，56℃1min，72℃1min，循环35次后，72℃延长10min。取PCR扩增产物8ul经2%琼脂糖凝胶电泳后，观察90bp的特异性扩增带。

    1.3.2  SSCP银染  取8μl PCR反应产物与2倍体积的变性液（95%去离子甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青蓝），97℃变性5min，冰中骤冷，迅速加样，进行8%[丙烯酰胺：甲叉（N，N′?亚甲双丙稀酰胺）=49∶1]非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，室温冷凝水循环降温，预电泳150V，30min，电泳280V，至指示剂溴酚蓝走至凝胶下缘（约4h）。取下凝胶，进行硝酸银染色，10%冰醋酸固定15min后，依次进行染色、显色至条带清晰。

    1.3.3  结果分析  正常组织和肿瘤组织在同一条件下进行扩增、电泳、银染，如果出现完全一致的电泳条带，则判断TGF?β RⅡ正常；如果电泳中发现肿瘤标本条带增多、丢失或移位，则判断TGF?β RⅡ有突变，见图1。

    1.4  大肠癌组织微卫星不稳定（MSI）的鉴定

    1.4.1  MSI的鉴定  根据［1，2］，选用BAT?26特定微卫星位点作为MSI的判定标准，采用PCR方法扩增微卫星DNA，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，具有特异扩增带的标本用于SSCP银染分析，方法同1.3.2所述。

    BAT?26引物序列为：

    Forward 5′?TGACTACTTTTGACTTCAGCC?3′

    Reverse 5′?AACCATTCAACATTTTTAACC?3′

    1.4.2  结果分析  正常组织和肿瘤组织DNA在同一条件下进行扩增、电泳、银染，如果出现完全一致的电泳条带，则判断MSI阴性；如果电泳中发现肿瘤标本条带增多、丢失或移位，则判断MSI阳性，见图2。

　   1.5  统计学分析

    采用χ2检验对实验数据进行统计学分析。

    2  结果

    2.1  大肠腺瘤及大肠癌中TGF?β RⅡ突变率  见表1。

    2.2  大肠腺瘤及大肠癌中MSI分析  见表1。表1  大肠良恶性肿瘤中TGF?βRⅡ突变及MSI状态分析

    不同组织TGF?βRⅡ突变+-突变率

    （%）MSI状态+-阳性率

    （%）大肠癌164426.67184230.00大肠腺瘤53711.90103223.81正常组织01600160

    χ2检验：与正常组比较P＜0.05，大肠癌与大肠腺瘤组比较P＜0.05

    2.3  大肠癌中TGF?β RⅡ突变与MSI的关系

    60例大肠癌标本中,伴MSI者18例，其中16例发生TGF?β RⅡ突变，而另外42例无MSI者无1例发生TGF?β RⅡ突变，二者之间有明显相关性（P＜0.01）。

    2.4  大肠癌中TGF?β RⅡ突变与临床病理参数间的关系  见表2。表2  TGF?β RⅡ突变及MSI状态与大肠癌

    2.5  大肠腺瘤TGF?β RⅡ突变与临床病理参数间的关系

    大肠腺瘤TGF?β RⅡ突变多发生在近端结肠（P＜0.01），大肠腺瘤向大肠癌发生过程中，TGF?β RⅡ突变率是逐步升高的，此突变只发生在腺瘤伴中重度不典型增生或癌旁腺瘤中，TGF?β RⅡ突变是晚期腺瘤向肿瘤转化的一个特征。

    3  讨论

    最近研究发现，TGF?β RⅡ的改变与其基因的点突变有关，主要表现为其基因cDNA790?718 Poly（A）10区腺苷酸的插入或缺失，这种改变使基因发生框架移动，表达出异常的RⅡ受体，使RⅡ传递信号的功能丧失，从而使细胞失去对TGF?β的反应［4］。本实验应用PCR?SSCP银染方法检测了60例大肠癌组织标本，结果发现有26.7%在此位点发生了突变，且这种突变与大肠癌生物学行为密切相关。多发生在右半结肠、大多有家族史、且多为分化不良型腺癌，Duke’s A、B期患者较Duke’s C、D期所占比例高，而与患者年龄、性别无明显相关。本实验研究发现，大肠癌中TGF?β RⅡ与基因组微卫星不稳定性有密切关系，伴有MSI的18例大肠癌有16例发生TGF?β RⅡ突变，另外42例无MSI者无1例发生TGF?β RⅡ突变。Myeoff等［5］研究显示，结肠癌细胞系中有32%存在TGF?β RⅡ突变，且与MSI密切相关。Markowitz等［6］对38种结肠癌细胞株进行研究时发现有12种TGF?β RⅡ表达异常，其中在伴MSI的11种细胞株中有9种出现了TGF?β RⅡ表达异常，而另外27种细胞株中只有3种表达异常，因而TGF?β RⅡ基因突变与伴MSI的大肠癌发生密切相关。

    本研究的42例大肠腺瘤中，5例检出了TGF?β RⅡ基因突变且全部位于右半结肠，在组织学上均表现为绒毛状腺瘤伴重度不典型增生者，而早期腺瘤无1例出现这种改变，提示腺瘤向癌过程中，TGF?β RⅡ突变率是逐步升高的，腺瘤早期无TGF?β RⅡ基因突变，RⅡ突变只是晚期腺瘤的特征，由此表明TGF?β RⅡ基因突变在大肠腺瘤癌变过程中起着重要作用［7］。Manning等［8］研究发现结肠腺瘤向结肠癌发展过程中，对TGF?β抑制作用的反应性是逐渐下降的，如低浓度的TGF?β（0.05～0.5ng/ml）即对结肠腺瘤细胞株AA/G1、RG/G2产生明显的抑制作用，而同一来源的结肠腺癌细胞株RKO却对高浓度的TGF?β（2～10ng/ml）无反应，这也从一个方面揭示了细胞对TGF?β负调控作用的逃逸是癌变过程的重要步骤。

【】
  ［1］ Lecturer AS, Koilakou SV, Michalopoulos NV, et al. Evaluation of BAT?26 as an indicator of microsatellite instability in gallbladder carcinomas［J］.Hepatogastroenterology，2003，50(54): 1799?1802.

［2］ Hoang JM, Cottu PH, Thuille B, et al. BAT?26,an indicator of the replication error phenotype in colorectal cancers and cell lines［J］. Cancer Res, 1997, 57(2):300?303.

［3］ Fukushima T, Mashiko M, Takita K, et al. Mutational analysis of TGF?beta type II receptor, Smad2, Smad3, Smad4, Smad6 and Smad7 genes in colorectal cancer［J］. J Exp Clin Cancer Res, 2003, 22(2): 315?320.

［4］ Myeroff L,Parsons R, Kim SJ, et al. A TGF?β receptor type Ⅱgene mutation common in colon and gastric but rare in endometrial cancers with microsatellite instability［J］. Cancer Res, 1995, 55(23): 5545?5547.

［5］ Markowitz S, Wang J, Myeroff L, et al. Inactivation of the type Ⅱ TGF?β receptor in colon cancer cells with microsatellite instability［J］. Science, 1995, 268(5215): 1336?1338.

［6］ Grady WM, Rajput A, Myeroff L, et al. Mutation of the type II transforming growth factor?beta receptor is coincident with the transformation of human colon adenomas to malignant carcinomas［J］. Cancer Res, 1998, 58(14): 3101?3104.

［7］ Manning AM, Williams AC, Game SM, et al. Differential sensitivity of human colonic adenoma and carcinoma cells to TGF?βconversion of an adenoma cell line to a tumorigenic phenotype is accompnied by a reduced response to the inhibitory effects of TGF?β［J］. Oncogene, 1991, 6(8): 1471?1476.