pRb2/p130、cyclinD1和MUC1在食管鳞癌中的表达

                   作者：韩彪，张现伟，刘健，蒋鹏

【摘要】  　　目的 探讨pRb2/p130、cyclinD1和MUC1在食管鳞癌中的表达及意义。方法 应用免疫组化法检测了pRb2/p130、cyclinD1和MUC1在16例正常食管粘膜上皮及60例食管鳞癌中的表达水平，分析它们与临床病理指标及其三者之间相关关系。结果 食管鳞癌中pRb2/p130的低表达与癌组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度有关；cyclinD1的高表达与癌组织的分化程度、淋巴结转移相关；MUC1的高表达与淋巴结转移相关；Kaplan?Meier生存分析表明pRb2/p130高表达组生存率高于低表达组（P=0.0032,Log Rank检验）；Cox比例风险模型分析显示pRb2/p130、淋巴结转移、癌组织的分化程度是食管鳞癌的独立预后指标。结论 食管鳞状细胞癌中存在 pRb2/p130的低表达以及cyclinD1和MUC1的高表达，促进了细胞的生长和肿瘤的，是食管癌发生发展中的重要事件。

【关键词】  pRb2/p130　 cyclinD1；MUC1　免疫组化；食管鳞癌

　　Expression of pRb2/p130, cyclinD1 and MUC1 in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

        Key words：pRb2/p130; cyclinD1; MUC1; Immunohistochemistry; Esophageal squamous cell carcinoma

　我国是世界上食管癌高发区之一，患者的发病率和死亡率高，而预后差，严重威胁着人们的身心健康。寻找有效的肿瘤生物学标志物是提高食管癌患者的早期诊断、的一条有效途径。Rb（视网膜母细胞瘤）家族蛋白pRb2/p130参与细胞周期的负调控，cyclins（细胞周期素）/Cdks（细胞周期依赖性激酶）复合物通过调控其磷酸化水平，来控制细胞周期的进行。在肿瘤组织中其异常表达引起细胞周期调控失常导致细胞癌变的发生。MUC1（粘蛋白1）是一种高糖基化、高分子量的糖蛋白, 正常情况下广泛分布于人消化道、呼吸道、乳腺等多种上皮组织中,对上皮起润滑和保护作用。而在肿瘤组织中MUC1多出现异常表达。pRb2/p130、cyclinD1和MUC1可能成为新型的肿瘤生物学标志物。我们应用免疫组织化学方法检测pRb2/p130 、cyclinD1和MUC1在食管鳞癌中的表达,从而探讨三者与临床各个病理参数之间的关系,为其应用于食管癌早期临床诊断、治疗及判断预后提供依据。

　1  资料与方法

    1.1  临床资料  标本选自1999年6月～2004年1月兰州大学第一手术切除并经病理证实为食管鳞癌标本60例，其中男36例、女24例，年龄在35～82岁，平均年龄为61.2岁。有60例患者随访10～52个月病历资料。高中分化鳞癌31例（G1＋G2），低分化鳞癌29例（G3）；TNM分期：Ⅰ期12例,ⅡA期12例,ⅡB期13例,Ⅲ期23例,Ⅳ期0例；参照1997年国际抗癌联盟（UICC）分期标准进行分期；有淋巴结转移36例（N1），无淋巴结转移24例（N0）；浸润至粘膜和粘膜下16例（T1）；浸润至肌层20例（T2）；浸润至纤维膜层24例（T3）。所取标本的患者术前未接受任何放疗、化疗。正常食管粘膜标本16例作对照。标本经10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续4μm厚度切片。

    1.2  试剂与方法  鼠抗pRb2/p130单克隆抗体（北京莱博生物实验材料研究所），鼠抗cyclinD1单克隆抗体、鼠抗MUC1单克隆抗体、DAB显色剂、Immuno?Bridge+试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。用已知pRb2/p130阳性乳腺癌、cyclinD1阳性食管鳞癌及MUC1阳性乳腺癌组织作为阳性对照，PBS代替一抗作空白对照。实验步骤按照试剂盒说明进行。

    1.3  结果判断  pRb2/p130的阳性着色定位于细胞核和(或)细胞浆，cyclinD1的阳性着色定位于细胞核，MUC1阳性着色主要定位于细胞浆，棕黄染色作为阳性判断标准。每张切片由2名病理医师双盲观察，染色结果以阳性着色细胞数≤5％为阴性，阳性着色细胞数＞5％为阳性。

    1.4  统计分析  应用SPSS10.0统计软件χ2检验，Kaplan?Meier法绘制生存曲线，Log?rank检验进行生存分析，Cox比例风险模型进行统计学处理。(检验水准：α=0.05)

    2  结果

    2.1  pRb2/p130、cyclinD1和MUC1在食管鳞癌及正常食管粘膜中的表达  pRb2/p130阳性物质有胞核、胞浆及核浆三种表达形式，60例食管鳞癌中pRb2/p130阳性表达率为33.3%，明显低于正常食管粘膜上皮中pRb2/p130的表达率62.5%（P＜0.05）； cyclinD1阳性物质位于细胞核，60例食管鳞癌中cyclinD1阳性表达率为58.3%，与正常食管粘膜上皮中cyclinD1阳性表达率6.3%相比较,差异有统计学意义（P＜0.05）；MUC1阳性物质主要位于细胞浆，60例食管鳞癌中Cdk4阳性表达率为66.7%，与正常食管粘膜上皮中MUC1阳性表达率18.8%相比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。

    2.2  pRb2/p130、cyclinD1和MUC1的表达与食管癌临床病特征的关系  本研究60例食管鳞癌中，pRb2/p130的低表达与癌组织分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移状况差异有统计学意义(P＜0.05)；cyclinD1的高表达与癌组织分化程度、淋巴结转移状况差异有统计学意义(P＜0.05)；MUC1的高表达与淋巴结转移状况差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

    2.3  食管鳞癌中pRb2/p130、cyclinD1和MUC1三者表达的关系  配对χ2检验得出pRb2/p130、cyclinD1和MUC1三者在食管鳞癌中表达之间均有相关性(P＜0.05)，见表2。表1  pRb2/p130、cyclinD1和MUC1在食管鳞癌中 表达与临床病理学特征的关系表2  食管鳞癌中pRb2/p130、cyclinD1和MUC1表达的相互关系

    2.4  食管鳞癌患者生存分析  将60例食管鳞癌患者中，单因素分析pRb2/p130、cyclinD1和MUC1对生存率的影响通过Kaplan?Meier法绘制生存曲线，Log?rank检验显示，pRb2/p130阳性高表达组的累积生存率明显高于阴性低表达组（P=0.0032），见图1，cyclinD1和MUC1的阳性表达组与阴性表达组的累积生存率无统计学意义(P>0.05)。多因素Cox比例风险回归模型对患者年龄、性别、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度以及pRb2/p130、cyclin D1和MUC1的表达等可能与预后有关的指标进行分析，见表3。在α＝0.05的水平上逐步筛选，淋巴结转移、癌组织分化程度、pRb2/p130表达三个因素被筛入Cox模型内，其中淋巴结转移对预后的影响最大(风险度6.521，P＝0.001)。表3  Cox比例风险模型多因素分析

    3  讨论

    pRb2/p130是Rb2/p130抑癌基因的表达蛋白，其与pRb、p107三者共同组成了视网膜母细胞瘤家族(Rb家族)蛋白。三种蛋白的结构和功能相似作用相互补充，在细胞周期的进行中，通过对转录因子E2F家族成员活性的调节，在细胞周期的不同阶段发挥负调控功能，将正在分裂的细胞阻滞于G1期［1］。pRb2/p130通常与转录因子E2F家族成员结合，阻止后者的转录活性。在G1期，活化的Cdk4通过对pRb2/p130的磷酸化，使pRb2/p130与E2F解离，受E2F抑制的基因开始转录、表达。pRb2/p130功能的丧失使E2F的转录活性失控，为正常细胞的癌变及肿瘤细胞的失控增殖创造了条件。Nozoe等［2］研究表明，pRb2/p130在食管鳞癌中的表达明显低于正常组织，且与癌组织的分化程度相关，癌组织的分化程度越低，其表达也越低，患者的生存率也越低。郑素勤等［3］通过对101例肺癌组织的研究也表明，随癌组织分化程度由高到低，TNM分期的增加，pRb2/p130的表达也逐级降低。pRb2/p130作为核内蛋白，理应核内表达，但本实验结果有核内、胞浆、核浆三种表达形式。这与郑素勤等［3］实验结果一致，可能包含这些原因：(1)Rb2/p130基因突变；(2)石蜡标本的保存和处理不当,造成胞核超微结构的损伤,引起pRb2/p130异位表达。我们通过对60例食管鳞癌组织和16例正常食管组织的研究也表明，pRb2/p130在癌组织中的表达明显低于其在正常组织中的表达；且随癌组织由高分化到低分化，TNM分期的增加，淋巴结转移和浸润加深，pRb2/p130的表达在逐步降低。用Kaplan?Meier法和Log?rank检验分析，pRb2/p130在癌组织中阳性表达的患者生存率明显高于其阴性表达的患者；Cox比例风险模型分析示pRb2/p130的表达水平是危险因子，可作为食管鳞癌患者的预后指标。

    cyclin D1与Cdks家族成员结合成cyclin D1/Cdks复合物通过磷酸化视网膜母细胞瘤家族（Rb家族）蛋白而释放E2F因子，游离的E2F与特殊基因启动子区结合，这些基因开始转录和表达，促进细胞完成G1期到S期的转变。cyclin D1的过表达使细胞G1期明显缩短，细胞增殖加速，最终导致癌变的发生。Wu等［4］通过对70例食管鳞癌的研究表明，cyclin D1在癌组织中有过表达，且随癌组织由高分化到低分化其表达在明显增强。Itami等［5］对156例食管鳞癌的研究结果显示，cyclin D1在低分化鳞癌中的表达远高与在高分化鳞癌中的表达。本研究结果为，cyclin D1的表达在核内，且虽随癌组织由高分化到低分化、淋巴结转移表达的百分率在增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；cyclin D1异常表达是食管癌发生中的早期事件。

    MUC1(粘蛋白1)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，可使E2钙粘蛋白下调表达,E2钙粘蛋白的下调表达促进了肿瘤细胞的侵袭与转移［6］。MUC1通过在细胞表面的过度表达减小细胞与细胞、细胞与细外基质间的粘附使肿瘤细胞易于从原发位脱离［7］。Suwa等［8］证明当肿瘤细胞转染MUC1基因后,肿瘤细胞获得了更高的移动性和侵袭性。王恕怀等［9］对60例胃癌的研究证明MUC1的表达与淋巴结转移、癌组织进展呈正相关，庄则豪等［10］通过对50例食管鳞癌的研究也发现MUC1的表达与淋巴结转移及癌组织进展密切相关。本研究发现,MUC1免疫反应程度随淋巴结转移呈增强趋势,即无淋巴结转移组原发灶的MUC1免疫反应强度较淋巴结转移组低,提示MUC1的表达程度与肿瘤细胞的转移密切相关。

【】
  ［1］ Classon M,Dyson N. p107 and p130: versatile proteins with interesting pockets［J］. Exp Cell Res, 2001,264(4)：135?147.

［2］ Nozoe T, Korenaga D, Itoh S,et al.Clinicopatholoical significance of pRb2/p130 expression in squamous cell carcinoma of the esophagus［J］. J Cancer Res Clin Oncol,2002,10:1007?1008.

［3］ 郑素勤,王利民,孙瑞军,等. 人体肺癌组织内pRb2/p130的表达及意义［J］. 综合临床,2002,18(9):827?828.

［4］ Ming?Yao Wu, Chu?Xiang Zhuang, Huan?Xing Yang, et al.Expression of Egr?1,c?fos and cyclinD1 in esophageal cancer and its precursors: an immunohistochemical and in situ hybridization study［J］. World J Gastroenterol,2005,10(4): 476?480.

［5］ Itami A, Shimada Y, Watanabe G, et al. Prognostic value of p27(Kip1) and cyclinD1 expression in esophageal cancer［J］.Oncology,1999,57(4):311?317.

［6］ Hirasawa Y,Kohno N ,Yokoyama A ,et al . Natural antoantibody to MUC1 is a prognostic indicator for non2small cell lung cancer［J］. Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2 Pt l):589?594.

［7］ 张立新,李春海. MUC1粘蛋白的免疫生物学作用及其在肿瘤生物中的应用［J］.中国肿瘤生物治疗杂志,2000,7(3):165?170.

［8］ Suwa T , Hinoda Y, Mskiguchi Y, et al.Increased invasiveness of MUC1cDNA2 transfected human gastric cancer MKN74 cells［J］. Int J Cancer, 1998,76(3):377?382.

［9］ 王恕怀,邹天彪,程慧,等. MUC1 粘蛋白在进展期胃癌中的表达及临床意义［J］. 哈尔滨医科大学学报,2003,3(37):251?253.

［10］庄则豪,王立东,高珊珊,等. 河南食管癌高发区食管和贲门癌组织中粘蛋白1 的表达［J］. 郑州大学学报(医学版),2002,6（37）:774?777.