原发性肺癌中DMBT1基因的表达

                作者：文海云，罗松古，李君，何建猷

【摘要】  　　目的 探讨原发性肺癌组织中DMBT1基因表达水平与肺癌临床和病理特征的关系。方法 以逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）检测原发性肺癌中DMBT1基因的表达水平。结果 37例原发性肺癌中10例DMBT1表达正常(27.03%,10/37)，有27例DMBT1表达低下或完全无表达（72.97%,27/37）;DMBT1的表达与原发性肺癌的病理类型、TNM分期、吸烟史等均无明显相关(P＞0.05)，但与肺癌组织分化程度及有无淋巴结和(或)远处转移有相关性（P＜0.01）。 结论 DMBT1基因的表达水平与肺癌的发生和肿瘤细胞分化程度及是否存在转移明显相关。

【关键词】  原发性肺癌　DMBT1基因表达　逆转录?聚合酶链反应

　　The Expression of DMBT1 Gene in Primary Lung Cancer

           Key words：Primary lung cancer; DMBT1 gene expression; RT?PCR

　DMBT1为近年来新发现的一种可能抑癌基因[1] ，它的突变失活被认为与多种肿瘤的发生密切相关，国内外已对肺癌与DMBT1之间的关系做了一些研究，并认为DMBT1至少存在两方面的功能，一方面与免疫防御和免疫监督有关，另一方面与上皮细胞分化有关[2]，本文作者曾有文章报道原发性肺癌中DMBT1基因纯合性缺失的情况[3]，为进一步探讨DMBT1基因与原发性肺癌发生、发展和转移的关系，本研究应用逆转录?聚合酶链反应（Reverse Transcription?Polymerase Chain Reaction，RT?PCR）的方法检测了37例原发性肺癌组织中DMBT1基因表达水平的情况，并分析其与原发性肺癌生物学行为的关系。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  组织标本  取自广东医学院附属、湛江市中心人民医院和广东省农垦中心医院心胸外科2002年10月～2003年6月住院患者手术切除的肺组织，并经病检查确诊。全部标本均在手术时收集，取材后在1.5h内放入－70℃冰箱保存待检。肿瘤组织均在原发灶中心取材，并且避开坏死组织；癌旁正常肺组织取自距离肿块5cm以上的肺组织，并经病理学检查未见癌细胞。其中原发性肺癌患者37例，肺良性疾病患者5例。原发性肺癌患者临床病理特点详见表1。这里吸烟史的定义是指一个人曾经每天吸烟至少一支，时间至少一年[4]。肺良性疾病中，男性4例，女性1例，其中肺结核3例，支气管扩张2例。表1  DMBT1表达水平与原发性肺癌患者

    临床病理特征的关系

    病例特点例数DMBT1表达失活正常P年龄－63±965±8＞0.05(t=0.385)性别1.000  女性1293  男性25187肿瘤大小(cm)－5.0±1.45.1±1.8＞0.05(t=0.269)肿瘤分类0.460  中心型20164  周围型17116病理类型1.000  非小细胞肺癌

    1.1.2  主要试剂  异丙醇、氯仿和乙醇等均为国产分析纯，Trizol reagent购自 GIBICO公司，逆转录试剂盒购自广州基因工程公司，实验试剂均用无菌去离子三蒸水配制。

    1.1.3  引物  引物设计参照，均由上海生物工程公司合成，包括5’末端、3’末端和β?actin引物，见表2。表2  引物序列

    引物引物序列5’末端片段引物5’?GCA GCA GAA ATA TAC CAC CC?3’(sense)（A/2AS）5’?CCA CCC ACC TGT AGA TAG?3’(antisense)3’末端片段引物     5’?CAG GAG CTA TCT CCA ATC?3’(sense)（4A/4AS）      5’?ACA CCA AGA GGA ACA TCC?3’(antisense)β?actin引物      5’?CTC ACA TCG TGC CCA TCT AT?3’(sense)5’?GAT CCT TGC GAA TAT CCA CA?3’(antisense)

    1.2  方法

    1.2.1  RNA的抽提  用Trizol抽提法提取肺组织RNA，分光光度计测定其OD值，纯净RNA的OD260/OD280比值要≥2.0。

    1.2.2  RT?PCR  选择cDNA上的两个位点（5’末端、3’末端）进行PCR扩增，扩增片断分别为233bp、746bp，内参β?actin（扩增片断为415bp）被用来鉴定cDNA的质量。未加模板的反应管被用来作为阴性对照，以排除污染。反应体系组成：Total volume 25μl，Template RNA 3μl ，QIAGEN One Step RT?PCR Enzyme Mix 1μl，5Q?Solution 5μl，5×QIAGEN One Step RT?PCR Buffer 5μl，dNTP Mix(10mM of each dNTP) 1μl，RNase?free water 5.9μl，RNase Inhibitor(optional)0.1μl，Primers(each  Primer)1μl。热循环参数：50℃逆转录30min，95℃始变性15min，30个主循环（94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min），72℃终延伸10min。

    1.2.3  电泳  RT?PCR产物在1.5%～2.0%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色20min，紫外灯下观察，摄像。RT?PCR产物电泳后应用Scion Image 软件进行面积灰度扫描，以密度代表其表达量。

    1.2.4  结果判定  首先比较癌旁正常组织与非癌症患者正常肺组织的光密度比值，然后比较同一患者的癌组织和相应癌旁正常肺组织的光密度比值，若癌组织/β?actin：癌旁组织/β?actin≤0.5，则为癌组织DMBT1表达降低或者缺乏 [5]，见图2、3。

    1.2.5  统计学处理  组间均值比较采用t检验及四格表确切概率法（Fisher’s exact test），数据处理采用SPSS软件。

    2  结果

    2.1  原发性肺癌中DMBT1基因表达

    在30例NSCLC中DMBT1基因有22例表达低下或者完全缺乏(73.33%,22/30)，8例正常表达(26.67%,8/30)；在7例SCLC中有5例表达缺乏或低下(71.43%,5/7)，2例表达正常(28.57%,2/7),总表达缺乏率（72.97%，27/37），见表1，37例癌旁正常肺组织及5例良性肺疾病患者正常肺组织DMBT1表达均正常，见图1、2，且两个位点得出的结论一致。

    2.2  DMBT1基因表达水平与肺癌临床病理类型及TNM分期等的关系

    DMBT1基因表达水平与原发性肺癌临床病理类型、TNM分期、患者性别及年龄、吸烟史、原发肿瘤大小及肿瘤发生部位等均无明显相关(P＞0.05)；低分化和未分化癌患者的DMBT1表达水平(100%,13/13)明显低于高、中分化者(58.33%,14/24)(P＜0.01)；在伴有淋巴结和(或)远处转移的患者DMBT1表达水平(89.29%,25/28)显著低于不伴有转移者(22.22%,2/9)(P＜0.001)，见表1。

    3  讨论

    肺癌的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关。在人类多种肿瘤的发生发展中常存在染色体10q广泛的片断缺失，提示染色体10q可能存在抑癌基因。1997年，Mollenhauer等[1]首先报道了位于染色体10q25.3～26.1区域上的可能抑癌基因，因其是在以恶性脑肿瘤为对象的研究中发现并证明其存在缺失，因而将这个基因命名为DMBT1（Deleted in Malignant Brain Tumours 1）,自DMBT1基因被发现以来，在肺癌、消化系肿瘤及子宫内膜癌等方面均有研究，但在国内目前未见该基因表达水平与原发性肺癌关系的报道。

    本研究通过对DMBT1基因cDNA的3’末端和5’末端的两个片断进行扩增，检测了DMBT1在原发性肺癌组织中的表达水平，其高水平的表达缺失和低下率（72.97%）提示DMBT1基因与肺癌的发生密切相关。而DMBT1的表达水平与肿瘤细胞分化程度和是否有淋巴结和(或)远处转移明显相关（P＜0.01），进一步提示DMBT1基因的失活可能与肺癌的转移和肺癌细胞的分化程度密切相关。但是经统计学分析，DMBT1基因的表达水平与原发性肺癌的病理组织学类型、TNM分期、吸烟史、患者性别及年龄等无明显相关（P＞0.05），提示DMBT1的表达是独立于上述临床病特征之外的分子参数。另外，DMBT1基因在原发性肺癌中的高表达缺乏/低下率与纯合缺失率之间的不平衡以及DMBT1的失活与否和有无转移有显著相关性，而纯合性缺失与有无转移无明显相关[3]，两点均提示在原发性肺癌中DMBT1基因还存在另外的重要失活机制，Wu等[6]主要针对肺癌细胞株进行了DMBT1基因杂合性缺失(LOH)及点突变的研究，并得出了一些有趣的结论，我们准备在下一步的工作中针对原发性肺癌中DMBT1基因的LOH及点突变进行研究，以期进一步了解DMBT1的失活机制并探讨其与肺癌的关系。

    以上结果已经证实DMBT1基因在原发性肺癌中存在表达缺失和低下，认为它的失活对肺癌的分化和转移起着重要的作用。但是，对DMBT1所编码蛋白的详细功能及其调节机制以及信号传递目前并不十分清楚，另外DMBT1基因的失活与肺癌的发生发展之间的一些具体调控机制及把DMBT1野生型导入原发性肺癌组织细胞中是否能抑制其恶性表型，均需进一步深入研究。

【】
  　　
［1］ Mollenhauer J, Wiemann S, Scheurlen W, et al. DMBT1, a new member of the SRCR superfamily, on chromosome 10q25.3?26.1 is deleted in malignant brain tumours. Nat Genet, 1997,17(1):32?39.

[2] Mollenhauer J, Herbertz S,Holmskov U, et al. DMBT1 encodes a protein involved in the immune defense and in epithelia differentiation and is highly unstable in cancer. Cancer Res, 2000 Mar 15, 60(6):1704?1710

[3] 周爱莲，文海云，何建猷，等.DMBT1基因纯合性缺失与原发性肺癌临床病理特征的关系［J］.肿瘤防治研究，2003,30(3):184?186.

[4] 叶葶葶.预防医学［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2002.422?429.

[5]Wei Q,Xu X,Cheng L,et al. Simultaneous amplification of four DNA repair genes and β?actin in human lymphocytes by maltiplex reverse transcriptase?PCR［J］.Cancer Res,1995,55(11):5025?5029.

[6]Wu W, Kemp BL, Proctor M L, et al. Expression of DMBT1, a candidate tumor suppressor gene, is frequently lost in lung cancer［J］. Cancer Res, 1999, 59(8):1846?1851.