DNA?PKcs短发夹RNA载体的构建及其表达
作者：田晓予，邢辉，翁丹慧，陈刚，卢云萍，马丁
【摘要】 目的 构建DNA?PKcsshRNA表达载体，观察该基因的抑制对A2780细胞增殖活性的影响。方法 将针对人DNA?PKcs基因的不同部位设计的shRNA插入到真核表达质粒并转染人卵巢A2780细胞，RT?PCR和WesterBlot检测其对该基因mRNA和蛋白水平的抑制效率，MTT法测定DNA?PKcs基因的抑制对肿瘤细胞增殖活性的影响。结果 DNA 测序分析证实DNA－PKcs shRNA表达载体pSIRENDNA?PKcs shRNA构建成功并在细胞中表达，转染重组载体的A2780细胞DNA－PKcs的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降；重组载体转染细胞增殖活性明显降低。 结论 成功构建DNA－PKcs shRNA表达载体为进一步研究DNA损伤修复基因DNA－PKcs奠定了基础；DNA－PKcs表达的抑制可能会导致肿瘤细胞增殖活性降低。
【关键词】 DNA?PKcs基因；短发夹RNA；真核表达载体；细胞增殖活性
The Construction of DNA?Pkcs Short?hairpin siRNA Recombinant Vector and Its Expression in Vitro
Key words：DNA?PKcs; shRNA; Eukaryotic expression vector; Proliferation activity
DNA?PKcs蛋白是DNA蛋白依赖激酶（DNA?dependent Protein Kinase,DNA?PK）的催化亚基，在人类的DNA双链断裂(DSBs)的主要修复途径NEHJ(nonhomologous end?joining)中发挥重要作用。本课题选择DNA?PKcs编码区基因序列，与真核表达载体pSIREN构建DNA?PKcs的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）,在细胞内发挥RNA干扰作用，在转录后水平特异性封闭DNA?PKcs基因的表达，观察该基因的抑制对卵巢癌A2780细胞增殖的影响，并为进一步研究该基因生物作用奠定实验室基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞及主要试剂
卵巢癌A2780细胞株（武汉大学医学保障中心）， 胎牛血清（杭州四季青公司），1640培养液（Gibco BRL公司）,质粒 pSIREN?DNR?DsRed?Express（BD Clontech公司）, DH5α（清华天为时代），质粒小提试剂盒（北京博达泰克公司），凝胶回收试剂盒和质粒大提试剂盒（Qiagen公司）， Lipfectinamine2000脂质体转染试剂盒（Invitrogen公司）， PCR反应试剂盒（Fermentas公司），Trizol试剂（Invirtogen公司），各种工具酶（Takara公司），DNA?PKcs单克隆抗体（Neomarker公司），碱性磷酸酶抗鼠IgG（晶美公司），BCIP/NBT显色试剂盒（武汉凌飞科技有限公司），MTT（Sigma公司）， PCR引物及shRNA表达载体插入片段的寡核苷酸链由北京奥科生物公司合成，DNA?PKcs shRNA表达载体的测序由大连亚法生物技术公司完成。
1.1.2 主要仪器
CO2培养箱（Hereaus公司）， PCR仪和蛋白垂直电泳系统（美国Bio?Rad公司），酶标仪（美国Biotek公司产）。
1.2 方法
1.2.1 DNA?PKcs 特异性shRNA转绿模板设计
选择人类DNA?PKcs（Genebank U47077 ）cDNA两个部位作为目标序列，根据目前通用的siRNA设计原则，应用hppt:／／提供的“siRNA target finder and design tool” 设计DNA?PKcs 特异的19mt寡核苷酸序列加入9bp的loop环结构、U6启动子终止序列及两端的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，全长67bp ，以形成发卡状siRNA(shRNA)转录模板,正义链1：5’?GATCCCATGGCAGGAGAGAATCAGTTCAAGAGACTGATTCTCTCCTGCCATGTTTTTTGGAAG?3’反义链1：5’?AATTCTTCCAAAAAACATGGCAGGAGAGAATCAGTCTCTTGAACTGATTCTCTCCTCCATGG?3’正义链2: 5’?GATCCCTTTATGGTGGCCATGGAGCAAGAGACTCCATGGCCACCATAAAGTTTTTTGGAAG?3’反义链2:5’?AATTCTTCCAAAAAACTTTATGGTGGCCATGGAGTCTCTTGAACTCCATGGCCACCATAAAGG?3’。
1.2.2 DNA?PKcs shRNA表达质粒的构建与鉴定
重组质粒构建与鉴定过程：(1)将备用的pSIREN载体经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳分离，以凝胶纯化试剂盒纯化备用。(2)退火：分别用TE30μl溶解寡核苷酸单链，使其浓度为100μmol, 两条单链各取5μl混合，经95℃ 30s、72℃ 2min、37℃ 2min、25℃ 2min退火后备用。(3)连接：稀释上述产物至0.5μmol，按以下体系操作：将纯化的质粒片段2μl, 退火产物1μl ,10×T4DNALigase buffer1.5μl,BSA(10mg/ml)0.5μl,T4DNALigase0.5μl,H2O9.5μl,总体积15μl，室温孵育3h。(4)转化：将100μl感受态细胞放置冰上10min解冻，轻叩使其重悬，取6μl连接产物直接加入细菌悬液，轻轻混匀，冰上放置30min ，42℃水浴45s，置冰上2min，加900μl LB培养液，37℃ 250r/min,60min摇匀；取100μl菌液置于选择性固体培养基，用弯玻棒涂匀，普通培养箱37℃培养12～14h，见培养皿中长出菌落，挑取菌落3～4个分别放入2ml LB +2μl Amp、350r/min、37℃过夜，观察培养液变混浊，取500μl 菌液按照质粒小样快速提取说明书提取质粒，剩余菌液加等量甘油于－80℃保存。提取的重组质粒行双酶切鉴定，将连接成功的质粒样本根据插入片段不同命名为pSIREN?DNA?PKcs shRNA1和pSIREN?DNA?PKcs shRNA2送测序。
1.2.3 重组质粒转染A2780细胞
取对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化，调整细胞浓度为5×105个／ml ，分别接种96、24和6孔板中，细胞融合度为50%～70％时脂质体转染说明书，用阳离子脂质体Lipfectinamine2000将空质粒载体pSIREN和重组质粒pSIREN?DNA?PKcs shRNA1、pSIREN?DNA?PKcs shRNA2分别转染A2780细胞,选用未转染的细胞作空白对照，96、24和6孔板终体积分别为100μl、500μl和2ml,每孔含质粒分别为0.2μg、0.8μg和4μg，每孔含脂质体分别为0.5μl、2.0μl和10μl。转染后6h更换1640完全培养液终止转染。
1.2.4 RT?PCR
离心收集细胞， Trizol法提取细胞总RNA。逆转录条件：42℃ 60min、95℃ 5min、4℃ 10min,PCR条件：95℃ 预变性1min， 95℃ 30s、50℃ 45s、72℃ 10min、30个循环后，再72℃ 延伸10min。上游引物序列为5’?TTATGCAGAAGCCCAGCT?3’,下游引物序列为5’?ATTATGGAGTTTACCACGAC ?3’，片段长度为377bp，内参照片段扩增条件不变，其上下游引物序列分别为5’?ACGGATTTGGTCGTATTGGG?3’ 和5’?TGATTTTGGAGGGATCTCGC?3’ ，片段长度为230 bp。
1.2.5 Wester Blot法
用裂解缓冲液提取细胞总蛋白，经Bradford法定量后进行SDS?PAGE电泳，上样量为80μg，将电泳后分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶封闭，分别加一抗DNA?PKcs(1∶300 )和β－actin（1∶1000），4℃过夜， TBST洗3遍，每次15min,分别加碱性磷酸酶标记二抗（1∶500）37℃作用 1h,TBST洗3遍，BCIP/NBT显色。
1.2.6 MTT法测定细胞增殖情况
取对数生长期细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，种96孔板,6 000～8 000个细胞/孔，终体积100μl,细胞贴壁后，加入无血清培养液12h使细胞同步化，设未转染细胞组、空载体pSIREN组和重组质粒pSIREN?DNA?PKcs shRNA2组，每组设三个平行孔。分别在转染后24h、48h和72h取出一个培养板每孔加MTT（5mg/ml）10μl，培养4h，弃培养液，每孔加二甲基亚砜100μl，测波长为570nm处的吸光度值A。细胞生存率＝实验组平均A值／空白对照组A值×100％。
1.3 统计学处理
采用SPSS12.0统计软件进行χ2检验，差异显著性标准为P<0.05。
2 结果
2.1 重组载体限制性酶切鉴定
将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后行琼脂糖凝胶电泳，见与插入片段（67bp）大小相符的条带，未酶切的相应重组质粒未见插入片段的条带，并经测序得以证实。
2.2 荧光显微镜观察转染质粒的表达
pSIREN?DNA?PKcs shRNA转染A2780细胞后24h、48h和72h观察被转染细胞，红色荧光蛋白表达表明重组载体转染成功，其中 48h转染效率最高，见图1。
2.3 DNA?PKcs?shRNA对DNA?PKcs mRNA水平的抑制
提取转染后48h细胞RNA，RT?PCR结果提示，转染细胞A2780/pSIREN?DNA?PKcs shRNA1和A2780/pSlREN?DNA?PKcs shRNA 2组与A2780/pSIREN和A2780细胞组相比，DNA?PKcs mRNA表达下降，以A2780/pSIREN?DNA?PKcs shRNA2更明显，而A2780/pSIREN与A2780细胞相比，DNA?PKcs mRNA表达没有明显变化，见图2。
1:A2780/pSIREN?DNA?PKcs shRNA2；2:A2780/pSIREN?DNA?PKcs shRNA1；3:A2780/pSIREN；4:A2780；5: marker
图2 A2780细胞转染pSIREN?DNA?PKcs shRNA后
48h DNA?PKcsmRNA的表达
2.4 DNA?PKcs?shRNA对 DNA?PKcs蛋白水平的抑制
转染细胞48h后Wester Blot提示，pSIREN?DNA?PKcs shRNA1和pSIREN?DNA?PKcs shRNA2均可明显抑制DNA?PKcs蛋白的表达，以pSIREN?DNA?PKcs shRNA2抑制作用较强，而A2780/pSIREN无明显抑制作用，见图3。
1:A2780；2:A2780/pSIREN；3:A2780/pSIREN?DNA?PKcs shRNA1；4:A2780/pSIREN?DNA?PKcs shRNA2
图3 A2780细胞转染pSIREN?DNA?PKcs shRNA后
48h DNA?PKcs蛋白的表达
2.5 DNA?PKcs表达的抑制对细胞增殖的影响
pSIREN?DNA?PKcs shRNA2组24h、 48h、72h和96h生存率分别为91.3％、75.0％、58.5％和54.6％， pSIREN组分别为98.9％、97.2％、90.0％和95.0％，见图4，两组生存率相比转染后24h无显著性差异（P>0.05）,转染后48h、72h和96h均有显著差异（P<0.05）。
3 讨论
RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种特异性转录后基因沉默的过程。近几年来RNAi技术越来越多地应用于特异性阻断目的基因表达的研究中。在哺乳动物细胞中，RNAi由21～23个核苷酸组成的双链小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）引发，siRNA可以在体外合成或通过表达载体在细胞内合成，研究表明体内合成siRNA具有成本低、表达时间长和更接近生物体产生RNAi的机制等特点。Paddison等［1］ 选择靶基因的19～29碱记为模板合成60～75bp的双链DNA链 插入质粒中，含U6启动子，转染后48h观察效应，抑制率达80%～90％。Brummelkamp等［2］研究提示，在设计插入序列时， 环路结构（loop）以9个碱基效率最高，7个次之，5个几乎无功能。Spencer 等［3］按照上述原则以DNA－PKcs 基因为靶点，构建了DNA－PKcs shRNA表达载体，转染人前列腺癌细胞后48h转染效率最高达90％，96h恢复到与空载体组和未转染组相同。本实验采用带有红色荧光蛋白基因的质粒，成功构建了DNA?PKcs?shRNA表达载体，结果表明：在荧光显微镜下可以直接观察转染的效果，pSIREN?DNA?PKcs shRNA1和pSlREN?DNA?PKcs shRNA2成功转染A2780细胞后，经RT?PCR和Westerblotting检测，在mRNA和蛋白水平均抑制了DNA?PKcs的表达，但不同的目的片段设计的shRNA其抑制DNA?PKcs表达的效率是不同的，高效的DNA?PKcs shRNA表达载体为进一步研究DNA?PKcs的功能和作用机制提供了实验基础。
在NEHJ途径中，DNA?PKcs蛋白能够单独或作为多蛋白复合物的一部分，保护和连接断裂的DNA断端，是修复DSBs的主要因子，在维持端粒的稳定性和降低细胞的自吞作用等方面发挥重要作用。 Peng［4］等用DNA?PKcs siRNA转染淋巴母细胞，表明DNA?PKcs敲除的细胞生存曲线比未转染或模仿转染的细胞低。本实验结果也表明A2780细胞DNA?PKcs表达被抑制后细胞的增殖活性是降低的。说明DNA－PKcs对于保持细胞正常的增殖活性和维持细胞遗传物质的稳定可能是至关重要的。
DNA?PKcs在许多肿瘤细胞中表达是增强的，肿瘤细胞会利用DNA?PK的修复能力增强使细胞对抗癌产生抵抗作用，DNA?PKcs被降调节后肿瘤细胞对放射线敏感性增加已得到大家的公认[5，6]。目前很多抗肿瘤药物是通过损伤肿瘤细胞DNA而发挥作用的,而肿瘤组织中DNA?PK的过度表达有可能导致对化学药物的抵抗性，阿霉素获得性耐药细胞株HL60的DNA?PKcs的表达较敏感细胞增高15倍，DNA?PK活性增加3倍，抑制DNA?PKcs表达后可部分逆转细胞的抗药性［7］；DNA?PK和GST一起参与了肿瘤细胞多药耐药的形成，联合应用DNA?PK的抑制剂wortmannin可使细胞对抗肿瘤药物的敏感性增加［8］；用反义核酸抑制Hele细胞DNA?PKcs的表达使该细胞对顺铂的敏感性提高［9］，DNA?PKcs与抗癌药物的敏感性的关系已越来越被学者们关注。
总之，DNA－PKcs可能是影响肿瘤发生和治疗效果的重要基因靶点，用RNA干扰这一高效的基因沉默技术靶向干预DNA修复蛋白DNA－PKcs的表达对该基因进行更深入有效的研究可能为肿瘤耐药的逆转和化疗的增敏提供新的途径。
【】
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