维生素E琥珀酸酯下调mdr1/P?gp表达逆转K562/ADM耐药细胞的凋亡抑制

            作者：郭璐，魏虎来， 张亚莉， 刘建民

【摘要】  　　目的 研究维生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）诱导多药耐药K562/ADM细胞凋亡的分子机制。方法 采用四氮唑蓝比色法（MTT）检测K562/ADM增殖活性；细胞形态学和Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡；RT?PCR检测mdr1基因和Caspase?3基因mRNA的表达；流式细胞法（FCM）测定P?gp蛋白表达水平和Caspase?3活性。结果 VES显著抑制K562/ADM细胞的增殖；经VES处理后细胞形态上出现典型的凋亡改变；Annexin Ⅴ/PI双染检测凋亡细胞明显增加；mdr1 mRNA表达和P?糖蛋白（P?glycoprotein，P?gp）合成明显降低，Caspase?3 mRNA表达和Caspase?3活性显著增强；VES增加K562/ADM细胞对ADM的敏感性。结论 VES诱导mdr1/P?gp高表达的K562/ADM耐药细胞凋亡，其主要机制为下调mdr1/P?gp表达而逆转P?gp介导的细胞凋亡抑制和耐药性。

【关键词】  维生素E琥珀酸酯　多药耐药　凋亡抑制　P?糖蛋白；Caspase?3；白血病

    Key words：Vitamin E succinate;  Multidrug resistance; Apoptosis resistance; P?glycoprotein; Caspase?3; Leukemia

　　维生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）是α?生育酚的6位羟基与琥珀酸酯化而形成的衍生物。研究证实，VES可选择性地杀伤人白血病、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤细胞，而对正常细胞无抑制效应[1?3]。有关VES对耐药白血病（肿瘤）细胞作用的研究少见，我们曾研究证实VES可抑制白血病K562/ADM耐药细胞增殖并诱导其凋亡[4]。本文以白血病多药耐药K562/ADM细胞为模型，观察VES诱导其凋亡过程中耐药基因mdr1及其编码产物P?糖蛋白（P?glycoprotein，P?gp）表达的变化，探讨VES诱导耐药细胞凋亡的分子机制。

    1  材料和方法

    1.1  试剂

    维生素E琥珀酸酯（Vitamin E succinate, VES）为美国Sigma公司产品，用无水乙醇配制成50 mmol/L的储存液。RPMI1640为美国Gibco BRL公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。阿霉素（ADM）为日本明治制药公司产品。MTT、SDS、琼脂糖、RNase、溴化丙锭（EB）、碘化丙啶（PI）和二乙基焦碳酸（DEPC）均由美国Sigma公司出品。100bp DNA Ladder Marker由美国Promega公司出品。抗P?gp单抗（MRK16）为Kamiya Biomedical公司产品，PE标记的羊抗鼠IgG2a为Caltag公司产品。TRIZOL试剂由美国Invitrogen公司生产。AMV一步法RT?PCR试剂盒购自上海生物工程有限公司。mdrl、Caspase?3和β?actin基因引物由上海生物工程有限公司合成。FITC标记的DEVD?FMK和Annexin V试剂盒为Biovision公司产品。

    1.2  细胞培养

    K562/ADM多药耐药白血病细胞由兰州大学医学实验中心保存，细胞在含有15%小牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mmol/L L?谷氨酰胺的RPMI1640完全培养基中，置37℃、5%CO2孵箱中培养，定期添加ADM（～5.0mg/L）以刺激mdr1/P?gp高表达。细胞在无ADM的条件下培养1周后用于实验。

    1.3  细胞增殖活性

    K562/ADM细胞以2×108/L接种于96孔培养板（Costar）中，分别加入10～60μmol/L VES，对照组加入终浓度<0.2%（V/V）的无水乙醇。培养24～96h后MTT比色法[5]检测，并细胞增殖抑制率和半数抑制浓度（IC50）。

    1.4  细胞形态学观察

    VES处理后的K562/ADM细胞，细胞离心涂片机（StatSpin Cytofuge 2型）离心涂片，Wrigh?Giemsa染色，光镜观察。同时收集细胞，3%戊二醛固定，经脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，铀铅双重染色，透射电镜（JEM?1230）观察细胞超微结构。

    1.5  Annexin Ⅴ/PI双标记检测凋亡细胞

    按试剂盒说明操作。收集K562/ADM细胞，PBS洗涤，重悬于Binding Buffer中，加入PI和FITC 标记的Annexin Ⅴ， 室温避光染色5min，流式细胞仪（Beckman?Coulter Epics XL）检测[6]。

    1.6  RT?PCR检测mdr1和Caspase?3基因mRNA表达

    TRIZOL法提取细胞总RNA，以β?actin为内参照，AMV一步法RT?PCR检测 mdr1和Caspase?3 基因mRNA表达情况。引物分别为：mdr1：上游5’?CCCATCATTGCAATAGCAGG?3’，下游5’?GTTCAAACTTCTGCTCCTGA?3’，扩增产物167bp；Caspase?3:上游5’?CAAACTTTTTCAGAGGGGATCG?3’，下游5’?GCATACTGTTTCAGCATGGCAC?3’，扩增产物272 bp；β?actin：上游5’?GTGGGGCGCCCCAGGCACCA?3’，下游5’?CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC?3’，扩增产物548bp。PCR扩增产物凝胶电泳，凝胶图像分析系统（Syngene ChemiGenius 2）分析。

    1.7  P?gp表达测定

    收集K562/ADM细胞，PBS洗涤，分别加入鼠抗人P?gp单抗MRK?16（一抗）和PE标记的羊抗鼠IgG2a（二抗），FCM检测P?gp的表达阳性率和平均荧光强度（MFI）[7]。

    1.8  Caspase?3活性测定

    根据试剂盒说明操作。收集细胞，PBS洗涤，加入FITC?DEVD?FMK，37℃孵育1h，洗涤，FCM检测活化Caspase?3活性[8]。

    1.9  药物敏感性

    K562/ADM细胞经20μmol/L和40μmol/L VES与不同浓度的ADM联合处理48h，细胞终止培养后MTT比色法[5]检测并计算细胞增殖抑制率。

    1.10  统计学分析

    采用SPSS10.0统计软件进行相关性分析和直线回归。

    2  结果

    2.1  VES诱导K562/ADM细胞凋亡

    VES呈时间和浓度依赖性地抑制K562/ADM细胞增殖（P<0.01）， 24h、48h、72h和96h的IC50分别为77.9μmol/L、66.3μmol/L、49.7μmol/L和39.9μmol/L。经20μmol/L和40μmol/L VES处理后，K562/ADM细胞出现胞膜起泡，染色质凝集、核碎裂及凋亡小体形成等典型的凋亡形态学改变，见图1。Annexin V/PI染色显示凋亡细胞明显增高，20μmol/L和40μmol/L VES处理24h细胞凋亡率分别为29.0%和54.7%，48h为60.8%和74.8%。证实VES对K562/ADM细胞有明显的增殖抑制效应，并促使细胞凋亡。

    2.2  VES下调K562/ADM细胞mdr1 mRNA表达，抑制P?gp合成K562/ADM细胞mdr1/P?gp呈高表达。20μmol/L和40μmol/L VES后，mdr1 mRNA表达下降，凝胶图像分析，48h的表达抑制率分别为8.78%和46.54%，见图2； P?gp合成显著降低，72h时P?gp表达阳性率由98.2%降低至87.8%～75.1%，表达强度（MFI）降低约50%，见图3。

    2.3  VES上调K562/ADM细胞Caspase?3基因mRNA的表达，增强Caspase?3活性 K562/ADM细胞Caspase?3基因mRNA呈微弱表达。经20μmol/L和40μmol/L VES处理，Caspase?3 mRNA表达明显增高，凝胶图像分析显示分别增高24.3%和84.3%，见图2；Caspase?3活性显著增强，活化Caspase?3由9.3%增高至21.3%和39.8%，见图3。

    2.4  VES增加K562/ADM细胞对ADM的敏感性

    20μmol/L和40μmol/L VES 与不同浓度ADM共同作用48h，对K562/ADM细胞产生联合增殖抑制效应（P<0.05），见图4。VES与ADM的联合效应可能是VES抑制K562/ADM细胞P?gp表达，提高耐药细胞对抗癌药物ADM的敏感性，逆转细胞抗药性和凋亡抑制。

    白血病多药耐药（Multi?drug resistance，MDR）的发生均伴随着细胞凋亡抑制（Apoptosis resistance）现象，绝大多数常规抗癌药物几乎不能诱导耐药细胞凋亡。K562/ADM细胞是经阿霉素（ADM）长期诱导而获得的mdr1/P?gp超表达的白血病耐药细胞，对ADM、柔红霉素（DNR）、米托蒽醌（MIT）、高三尖杉酯碱（HHT）和足叶乙甙（Vp16）等抗癌药物表现出复杂的交叉耐药[9]。近年研究发现，P?gp除作为一种能量依赖“药泵”主动性地将药物从细胞内排出而导致耐药外，还通过抑制Caspase?3和Caspase?8等的激活而介导耐药细胞的凋亡抑制[7,10,11]，因此，P?gp在白血病耐药细胞凋亡抑制的发生中起着关键作用。

    维生素E琥珀酸酯（VES）作为一种潜在的肿瘤细胞生长抑制剂，其抗肿瘤作用机制包括抑制肿瘤细胞DNA合成，诱导凋亡；阻断细胞周期使肿瘤细胞停滞于G1期；诱导细胞分化；促进转化生长因子β（transforming growth factor β, TGF?β）分泌与活化及TGF?βⅡ型受体的表达；促进肿瘤细胞表面Fas（CD95/APO?1）的表达等[1?3,12]。我们以前的研究证实VES可抑制耐药白血病细胞增殖，并诱导其凋亡[4]。白血病细胞发生MDR后，其生物学特性发生了很大的变化，因此，VES诱导耐药细胞凋亡的机制也可能异于药物敏感细胞。本研究发现，VES诱导K562/ADM耐药细胞凋亡过程中，mdr1 mRNA表达水平和P?gp合成量显著降低，而Caspase?3 mRNA表达水平和Caspase?3活性则明显增高，呈剂量和时间依赖性；同时发现VES可显著提高K562/ADM细胞对ADM的敏感性。鉴于P?gp在白血病耐药细胞耐药性和凋亡抵抗中的关键作用，我们的研究结果提示VES诱导白血病耐药细胞凋亡的机制与其抑制mdr1/p?gp表达，解除P?gp对Caspase?3等的抑制效应，并增加抗癌药物的敏感性，从而逆转因P?gp高表达所介导的凋亡抑制和细胞耐药有关。

    多药耐药白血病（肿瘤）细胞的凋亡抵抗现象和干预对策是目前肿瘤耐药研究的热点之一，鉴于维生素E及其衍生物的特性，深入研究其在干预白血病（肿瘤）耐药细胞凋亡抑制的作用及其可能的分子机制，将为临床耐药白血病（肿瘤）开发更新、更有效的药物提供依据。

【】
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