氯沙坦对肺纤维化大鼠一氧化氮和内皮素?1合成的影响

                  作者：裴毓华，扬春松，丁佑铭

【摘要】  目的 观察肺脏一氧化氮（NO）和内皮素?1（ET?1）在抗肿瘤药物博莱霉素（BLM）所致大鼠肺间质纤维化过程中的动态变化，探讨氯沙坦对大鼠肺纤维化模型的影响及其作用机制。方法 45只Wistar大鼠随机分为空白组、模型组和氯沙坦组，气管内灌注BLM造成肺纤维化模型，灌注次日开始灌胃给药。观察各组动物肺脏病理组织学改变、血浆及肺组织中NO2-/NO3-、ET?1含量、肺组织羟脯氨酸含量的变化。结果 肺组织及血浆中NO2-/NO3-含量在气管灌注BLM后迅速上升，第14天达高峰（与空白组相比，P＜0.01），于第28天基本恢复正常。肺中ET?1水平也明显升高（与空白组相比，P＜0.01）。氯沙坦能显著降低肺中NO、ET?1的升高，延缓肺纤维化的。结论 NO和ET?1在BLM所致肺间质纤维化的发生发展中起重要作用，氯沙坦能通过抑制NO、ET?1的产生达到治疗肺纤维化的目的。

【关键词】  氯沙坦 肺纤维化 博莱霉素 一氧化氮 内皮素?1

  Effect of Losartan on Nitric Oxide and Endothelin?1 in the Development of  Blomycin?induced Pulmonary Fibrosis in Rats

    Key words：Losartan; Pulmonary fibrosis; bleomycin； Nitric oxide; Endothelin?1

  　肺间质纤维化常是博莱霉素（BLM）、平阳霉素等抗肿瘤药物引起的严重不良反应，也是多种肺部疾病发展的最后阶段，发病机制复杂，且无有效治疗手段。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）在临床应用极广，但关于其治疗肺纤维化的实验研究较少，本文拟就氯沙坦对博莱霉素所致的大鼠肺纤维化模型中一氧化氮（Nitric oxide，NO）和内皮素（Endothelin，ET）的影响进行研究，探讨ARB治疗肺纤维化的作用机制。

    1材料与方法

    1.1材料

    BLM为天津河北制药厂产品，使用时以生理盐水配制成5mg/L；氯沙坦为默沙东公司产品；NO羟脯氨酸检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；ET?1放射免疫检测试剂盒购于北京东亚免疫技术研究所。

    1.2实验动物及分组

    武汉大学医学动物中心提供的健康Wistar大鼠45只，雌雄不拘，体重180～240g，按每组15只随机分为3组：空白组（C组）、模型组（B组）和氯沙坦治疗组（L组）。大鼠用乙醚麻醉后，按5mg/kg气管内灌注博莱霉素制作肺纤维化模型；空白组气管内注入相应体积的生理盐水。次日开始灌胃给药，分别给予生理盐水（C组，B组）、氯沙坦10mg/kg（L组）。3组动物均在气管内灌药后第7、14、28d各随机处死5只。

    1.3观测指标及方法

    1.3.1病理组织学改变  各组动物在处死当日腹腔注射2% 戊巴比妥钠（2ml/kg）麻醉，打开胸腔，完整分离出气管和双肺，用预冷的生理盐水冲洗后滤纸吸干。摘取左肺，经主支气管向肺内注入10%中性福尔马林，使胸膜展开，结扎主支气管后置10%中性福尔马林液中固定，沿肺门至胸膜行最大切面取材，常规制成5μm厚石蜡切片，行HE染色。

    1.3.2肺组织羟脯氨酸含量的测定  将肺组织按100mg加入1ml生理盐水的比例制备组织匀浆，用酸解法测定肺组织羟脯氨酸浓度，用考马斯亮蓝蛋白法测定匀浆组织中蛋白含量。

    1.3.3血浆及肺组织中NO2-/NO3-含量的测定  收集左颈总动脉血，分离血浆，置-20℃备用。取右下肺组织100mg，加生理盐水1ml，碾磨匀浆后离心20min，取上清-20℃保存。采用硝酸还原酶显色法，以比色法记取OD值，用标准曲线法NO2-/NO3-含量代表NO含量。

    1.3.4血浆及肺组织中ET?1含量的测定  取血2ml，分离血浆，-20℃保存；测定前室温复融，3000r/min 离心5min，取上清液测定ET?1含量。称取约100mg右下肺组织放入1mol/L 醋酸1ml 中略作碾磨，煮沸10min，匀浆，离心，取上清保存；测定时用5倍的0.1mol/L，pH7.4，内含1g/L BSA，1g/L NaN3，1g/L NaCl，0.1% (V/V) Triton X?100缓冲液稀释。采用非平衡放射免疫法测定。

    1.4统计学处理

    实验数据以±s表示，采用SPSS12.0统计软件,行方差分析及q检验，P<0.05为有统计学意义。

    2结果

    2.1病理变化

    2.1.1大体观察  空白组双肺呈粉红色。模型组第7天双肺有散在点灶状出血，第14天仍有陈旧出血，第28天时双肺苍白、体积缩小、硬度增加，表面有索条状凹沟，部分肺切面见小囊形成。氯沙坦组第7天双肺未见点灶状出血，第14天见少量点灶状出血及散在陈旧出血，第28天时双肺灰白、体积略缩、硬度稍增加，表面光滑。

    2.1.2光镜观察  空白组各观察点均未出现明显病变。模型组第7天时可见肺泡间隔水肿增宽、伴以少许巨噬细胞和淋巴细胞为主的细胞浸润，间质内开始出现成纤维细胞，肺泡腔内有巨噬细胞；第14天时，肺泡炎仍较重，纤维组织进一步增加；第28天时肺泡炎较前减轻，而肺纤维化程度加重，部分肺泡腔消失，为大量胶原纤维、成纤维细胞、淋巴细胞所占据。氯沙坦组与模型组的病理变化基本一致，但炎症出现的较晚、较轻，纤维化程度也较轻。

    2.1.3大鼠肺组织羟脯氨酸含量的变化  气管内灌注BLM后，第7天时模型组大鼠肺组织羟脯氨酸含量与空白组无明显差异（P＞0.05），第14天时高于空白组（2.41±0.39mg/g，1.28±0.28mg/g， P＜0.05），第28天时更为明显（P＜0.01）。氯沙坦组第14、28天时羟脯氨酸含量明显低于模型组（1.83±0.35mg/g，2.41±0.39mg/g，1.96±0.31mg/g，2.85±0.42mg/g， P＜0.01）。

    2.1.4大鼠血浆及肺组织中NO2-/NO3-含量的变化  模型组大鼠血浆及肺组织中NO2-/NO3-含量均在第14天时最高，第28天时最低， 第7、14天时血浆NO2-/NO3-含量明显高于空白组；而肺组织中NO2-/NO3-含量在整个病程中均高于空白组。给予氯沙坦后，BLM大鼠NO2-/NO3-含量的升高得到很大控制，明显低于未治疗组，见表1。

    2.1.5大鼠血浆及肺组织中ET?1含量的变化  大鼠经气管内灌注BLM后，第7天时血浆及肺组织中ET?1水平已升高，与空白组比较差异有显著性，并且随着病程的进展进一步升高。与模型组相比，氯沙坦组大鼠的ET?1水平有明显下降,见表2。

    3讨论

    一般认为，肺纤维化的形成要经过肺亚急性或表1大鼠血浆及肺组织中NO2-/NO3-水平表2大鼠血浆及肺组织中ET?1水平注：与C组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组相比，#P＜0.05，##P＜0.01慢性炎症、肺损伤和肺间质胶原堆积等过程。用抗肿瘤药物博莱霉素制备的肺纤维化动物模型，其病理组织学与生改变与人肺纤维化近似[1]，作为经典动物模型而被广泛应用。我们发现，注药后1～7天肺泡炎明显，7～14天肺内胶原纤维逐渐增多，28天肺泡结构破坏，肺纤维化形成，此与报道一致[1]。

    NO是近年来发现的既是效应分子又兼有第二信使和神经递质性能的生物活性物质，在舒张血管、传递神经信息和调控免疫功能方面均起十分重要的作用。文献报道[2,3]，在内毒素和细胞因子的作用下，肺泡巨噬细胞、动脉平滑肌细胞、气道上皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞以及肺成纤维细胞内诱导型一氧化氮合酶表达增强，导致肺内NO含量增加。肺内NO的大量生成有加重肺损伤和促进肺成纤维细胞增殖的作用[3]。肺组织羟脯氨酸在胶原组织中占13.4%，弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此其含量增高代表肺内胶原蛋白生成增多。本实验发现，BLM诱导大鼠肺纤维化过程中，肺内NO含量的升高是出现在肺纤维化早期，在胶原蛋白生成增多之前并延续到开始增多之时。因此，肺内NO的大量生成可能是诱发肺纤维化形成的因素之一。

    ET是一种极强的血管收缩因子，有三种同分异构体（ET?1、ET?2和ET?3），其中ET?1的活性最强。ET?1除具有血管活性作用外，还是促进细胞有丝分裂的细胞因子，能促使血管平滑肌细胞和肺成纤维细胞增殖，使胶原分泌合成增加，在哮喘、肺动脉高压和急性肺损伤等许多疾病的发病中起着重要作用，而胶原蛋白的合成增加也是肺纤维化的主要环节[4?6]。本实验结果显示，在BLM大鼠肺泡炎期，移行期和纤维化期，血浆ET?1含量明显高于正常对照组，尤其在肺泡炎期和纤维化期出现两个高峰，推测ET?1可能参与肺纤维化的渗出和增生过程。

    大量的实验及临床资料表明，肾素?血管紧张素系统（RAS）激活引起血管紧张素Ⅱ增加，上调某些细胞因子的分泌，可能是组织纤维化发生的关键环节。进一步的研究证实，血管紧张素转化酶抑制剂及ARB能下调AngⅡ诱导的某些细胞因子的表达从而具有干预组织纤维化的作用[7]。在肺纤维化时肺内RAS也处于激活状态，说明肺内阻断RAS可能延缓肺脏病理改变[9]。我们的研究结果证实，氯沙坦能阻止肺内NO2-/NO3-和ET?1含量的升高，明显降低大鼠肺组织羟脯氨酸的含量，对肺纤维化有显著的保护作用。

    总之，氯沙坦对由抗肿瘤药物博莱霉素所致的大鼠早期肺纤维化过程有干预作用，这可能是通过减少肺内NO和ET?1的合成来实现的。由于抗肿瘤药物博莱霉素导致的肺纤维化的作用机制极其复杂，参与因素众多，且目前氯沙坦在治疗肺纤维化方面的基础及临床研究较少，因此有待于进一步深入研究。

【文献】
  　　［1］ Punithavathi D,Venkatesan N,Babu M. Curcumin inhibition of bleomycin?induced pulmonary fibrosis in rats[J].Br J Pharmacol,2000,131(2):169?172.

［2］ Castranova V,Porter D,Millecchia L,et al.Effect of inhaled crystalline silica in a rat model: time course of pulmonary reactions[J].Mol Cellular Biochem,2002,234?235(1?2):177?184.

［3］ Romanska HM,Polak JM,Coleman RA,et al.iNOS gene upregulation is associated with the early proliferative response of human lung fibroblasts to cytokine stimulation[J].J Pathol,2002,197(3):372?379.

［4］ Hocher B,Schwarz A,Fagan KA,et al.Pulmonary fibrosis and chronic lung inflammation in ET?1 transgenic mice[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2000,23(1):19?26.

［5］ Reichenberger F,Schauer J,Kellner K,et al.Different expression of endothelin in the bronchoalveolar lavage in patients with pulmonary diseases[J].Lung,2001,179(3):163?174.

［6］ Carpagnano GE,Kharitonov SA,Wells AU,et al.Increased vitronectin and endothelin?1 in the breath condensate of patients with fibrosing lung disease[J].Respiration,2003,70(2):154?160.

［7］ 李旭,孟莹,张振书,等.培哚普利和氯沙坦抗实验性肝纤维化的研究[J].中华医学杂志,2003,83(14):1241?1245.