靶向survivin利用RNA干扰技术影响云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC凋亡的初步研究

                   作者：蒋鸿超 ，孙茂盛，赵丹，吕琳，孙强明，李鸿钧

【摘要】  　　目的 检测云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞内源凋亡抑制因子survivin基因的表达以及促进YTMLC细胞凋亡的情况。方法 构建和转染重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2至YTMLC细胞株,通过免疫荧光和半定量RT?PCR 检测survivin 蛋白表达及mRNA 转录水平的变化，并通过流式细胞仪使用PI?Annexin V双染法检测YTMLC细胞株的凋亡。结果 构建的2种重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin? 2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE?1和pshRNA?negative非特异对照质粒;通过半定量RT?PCR 检测到survivin基因mRNA转录明显减少,抑制率为80.60%和70.09%;通过PI? Annexin V 双染法检测YTMLC细胞的凋亡分别达（33.42±2.42）%（P<0.01）和（20.09±1.32）%（P<0.01）。结论 重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2 均可明显抑制YTMLC细胞内源survivin 的表达和mRNA 的转录均可并明显促进YTMLC细胞的凋亡,为survivin 介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础。

【关键词】  siRNA　云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC　survivin 基因;质粒;表达

　    Key words：siRNA; Yunnan Gejiu lung squamous carcinoma cells(YTMLC); survivin gene;Plasmid;Expression

　　0引言

    survivin 是一类仅在肿瘤细胞中表达的凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis,IAP),在肿瘤的发生、过程中具有重要作用[1]。研究表明,抑制survivin基因的表达可介导肿瘤细胞的凋亡,进而抑制肿瘤的生长[2]。本实验选择和设计针对survivin编码基因的siRNA靶序列,通过人工合成靶序列后构建表达siRNA靶序列的载体，并转染云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞,观察siRNA 能否诱导肿瘤细胞内源性survivin表达的沉默并介导肿瘤细胞的凋亡增加,为肿瘤的基因沉寂疗法提供实验基础。

    1材料和方法

    1.1材料与试剂

    1.1.1质粒、菌株和细胞

    siRNA表达质粒pGE?1 和非特异对照质粒pshRNA?negative 购自Stratagene公司;大肠杆菌SCS1购自Stratagene公司。云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞由本研究所保存。

    1.1.2试剂

    去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒和小量DNA切胶回收纯化试剂盒，小量细胞总RNA快速抽提纯化试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品；RT?PCR 试剂盒为Fermentas产品；内切酶、Taq酶、T4 DNA连接酶和DL2000 Marker购自TaKaRa 公司; 一抗为survivin兔IgG多抗(FL?142)购自Santa Cruz 公司；二抗为FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）购自北京中杉金桥公司;转染试剂LipofectamineTM 2000 购自Invitrogen 公司; PI?Annexin V双染试剂盒购自Immuntech公司;引物和寡聚核苷酸片段均由上海生工生物工程公司合成；DMSO、Tris碱和甘氨酸购自Sigma公司；细胞培养用RPMI1640购自Gibco/BRL公司；新生牛血清购自杭州四季青公司；其他试剂均为国产分析纯。

    1.2方法

    1.2.1靶向survivin的siRNA表达载体的靶序列的选择和合成

    以人survivin（NM001168）为对象，根据RNA设计原则[3]和survivin编码序列,利用Stratagene公司和Invitrogene公司的在线设计程序siRNA WizardTM 1.0分别设计19和29nt的DNA 片段各一,其中19nt的靶序列针对survivin的开放读码框的第387bp?405bp,其序列为5′GAA AGT GCG CCG TGC CAT C 3′，而29nt的靶序列针对survivin的开放读码框的第248bp?276bp，其序列为5′GTT GCG CTT TCC TTT CTG TCA AGA AGC AG 3′上述两个侯选序列通过美国生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）同源序列检索确定与其他基因家族没有同源性后进行载体构建。根据上述结果分别合成两对针对survivin编码序列的正义和反义的寡聚核苷酸片段。具体序列如下：survivin?1 siRNA (编码基因387bp?405bp),5′ GAT CCC GAA AGT GCG CCG TGC CAT CTC AAG AGG ATG GCA CGG CGC ACT TTC TTT TTT 3′（正义）和5′CTA GAA AAA AGA AAG TGC GCC GTG CCA TCC TCT TGA GAT GGC ACG CGC ACT TTC GG 3′(反义) ; survivin?2 siRNA (编码基因248bp?276bp),5′GAT CCC GTT GCG CTT TCC TTT CTG TCA AGA AGC AGG AAG CTT GCT GCT TCT TGA CAG AAA GGA AAG CGC AAC TTT TTT 3′(正义) 和5′CTA GAA AAA AGT TGC GCT TTC CTT TCT GTC AAG AAG CAG CAA GCT TCC TGC TTC TTG ACA GAA AGG AAA GCG CAA CGG 3′(反义) ; 合成的DNA 两端设计有BamHⅠ或XbaⅠ酶切位点 (下划线处)。

    1.2.2靶向survivin的siRNA表达载体的构建和鉴定

    上述合成的正义和反义的寡聚核苷酸片段等比例混合后经过93℃变性3min后退火30min得到双链寡聚核苷酸片段，利用T4 DNA连接酶分别与经BamHⅠ和XbaⅠ酶切并切胶回收纯化后pGE?1表达载体连接,构建siRNA表达重组载体pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2。将连接产物转化大肠杆菌SCS1，小提质粒后通过PCR验证双链寡聚核苷酸片段是否插入，PCR反应上游引物为5′ CGT CGA TTT TTG TGA TGC TCG TCA G 3′，而其下游引物为5′GAA GCA TTT ATC AGG GTT ATT GTC TCA TG 3′。反应条件是：94℃3min变性,94℃30s,55℃30s,72℃1min 30个循环后,72℃5min延伸，PCR产物使用4%琼脂糖电泳检测并进行序列鉴定。

    1.2.3细胞培养

    YTMLC细胞常规培养于含10%新生牛血清、100U/ ml 青霉素、100U/ ml链霉素的RPMI1640培养液中,培养条件为37℃,CO2 饱和度为5%,定期观察细胞生长情况,每2～3d用0.25%的胰酶消化,进行传代培养。

    1.2.4转染细胞

    应用小量质粒提取试剂盒,提取去内毒素重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2 (具体操作过程见说明书),并使用OD值进行DNA 定量。用Invitrogen 公司转染试剂LipofectamineTM 2000将正常培养的YTMLC细胞至汇合度90%时，用0.25%胰酶消化,800r/ min 离心,含10%血清但无抗生素的RPMI1640培养液重悬,每孔加1×106个/ ml 的等量细胞到6 孔板中,置37℃培养。 待细胞生长到占培养孔底约80%～90%时,培养液换为无抗菌素含10%血清的RPMI1640,培养过夜。转染载体按以下分:(1)脂质体组;(2)空质粒pGE?1;(3)非特异对照组pshRNA?negative; (4) pshRNA?survivin?1; (5) pshRNA?survivin?2。于次日,根据以上分组,每孔除(1)组外均按总量为0.8μg的质粒DNA分别进行转染,具体操作详见Invitrogen转染试剂盒说明。置37℃培养,4～6h后加入含15%血清的RPMI1640培养液,置37℃培养,转染72 h 后收集细胞进行检测。

    1.2.5免疫荧光

    转染72h后，6孔板的各孔细胞用PBS洗涤2次,4%多聚甲醛室温固定30min,之后用3%BSA 37℃封闭2h，一抗为兔抗survivin (Santa Cruz,USA) 1∶500加入37℃孵育2h,二抗为FITC标记山羊抗兔IgG（H+L）1∶5000加入37℃孵育1h。FITC标记的兔抗survivin 在荧光显微镜下(激发波长488nm，发射波长520nm) 呈绿色,观察荧光表达变化并照相。 随机选择5 个细胞区内200 倍(20×10倍) 视野,计数绿色荧光细胞数及总细胞数,绿色荧光细胞抑制率= [总细胞数? 绿色荧光细胞数] / 总细胞数×100 %。并对绿色荧光细胞抑制率作统计学分析。

    1.2.6半定量RT?PCR

    转染72h后用0.25%的胰酶消化,分别收集各组细胞,PBS洗涤两遍,按试剂盒说明分别提取各组细胞的总RNA，并使用OD值进行总RNA定量。各组均按总量为1.2μg的总RNA分别进行RT?PCR 反应。RT?PCR反应体系中各组均同时做两管，目的是分别各加入一对引物,第一对是内源对照三磷酸甘油醛脱氢酶( GAPDH ) 基因的引物,即上游引物5′CCA CCC ATG GCA  AAT TCC ATG GCA 3′和下游引物5′TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC 3′，其PCR产物大小为598bp;第二对是被沉寂的目的基因的引物,即survivin 基因的引物，即上游引物5′ ACG AGC CAG ACT TGG CCC AGT GTT 3′和下游引物 5′TCA ATC CAT GGC AGC CAG CTG CTC 3′，其PCR产物大小为281bp。 两管PCR的反应条件均为94℃3min 变性,96℃30s,65℃30s,72℃1min30个循环后,72℃5min延伸。PCR产物通过2%琼脂糖电泳检测。根据凝胶电泳中内源GAPDH 基因片段条带的强弱,来判定模板的量,进而确定survivin 基因的mRNA 被siRNA 沉寂的程度。survivin基因的mRNA 沉寂率= [细胞组的survivin PCR产物条带亮度OD值－重组质粒pshRNA－survivin 组的survivin PCR产物条带亮度OD值] /细胞组的survivin PCR产物条带亮度OD值×100%。

    1.2.7细胞凋亡检测

    转染6孔板的各组细胞72h后分别用0.25%胰酶消化，将正常细胞组和诱导凋亡组的悬浮成细胞浓度为1×105后，PBS洗涤2次。加入100μl Binding Buffer（10mM HEPES,140mM NaCl,2.5mM CaCl2,pH7.4）和 FITC 标记的Annexin?V(20μg/ml)10μl重悬,室温避光30min，再加入PI(50μg/ml)5μl，避光反应5min后，加入400μl Binding Buffer，立即用使用EPTC SXL?31240 Flow Cytometry (Coulter CO.)进行流式细胞术定量检测,其波长为488nm，同时以不加FITC 标记的Annexin?V和PI的一管作为阴性对照。

    1.3统计分析

    实验结果采用SPSS 12.0 软件进行统计学分析,用方差分析各组间差别。

    2结果

    2.1靶向survivin 的siRNA表达载体的构建和鉴定

    构建的siRNA重组表达载体pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2通过PCR验证双链寡聚核苷酸片段是否插入，结果pshRNA?survivin?1PCR产物大小为646bp，pshRNA?survivin?2  PCR产物大小为668bp，见图1，表明重组表达载体pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2的双链寡聚核苷酸片段均成功插入。将PCR鉴定阳性的重组表达载体pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2进一步进行测序，结果与预期一致。表明已成功构建siRNA重组表达载体pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2。

    2.2siRNA 抑制细胞中survivin 蛋白表达的免疫荧光结果

    survivin 蛋白是一种细胞内的胞浆蛋白,用FITC标记的抗体在荧光显微镜下呈绿色，见图2。脂质体和加入pGE? 1 质粒和非特异对照组pshRNA?negative为对照的肿瘤细胞,呈绿色荧光的细胞较多,亮度较强,而转染重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2 的细胞,呈绿色荧光的细胞

    （A）Lane1: Molecular mass marker DL2000; Lane 2: PCR product of pGE? 1（605bp）; Lane 3: PCR product of pshRNA?survivin?1（646bp）;

    （B）Lane1: Molecular mass marker DL2000; Lane 2: PCR product of pGE? 1（605bp）; Lane 3: PCR product of pshRNA?survivin?2（668bp）; Lane 4: PCR product of shRNA?survivin?2（668bp）

    图1两种重组质粒pshRNA?survivin的PCR鉴定

    较少,荧光明显减弱,统计分析证实二者之间无明显差异( F=0.55,P > 0.05),而与对照组相比有明显差异(F=4.33,P<0.05),说明构建的pshRNA?survivin?1 和pshRNA?survivin?2 两种siRNA 均能在肿瘤细胞中明显抑制目的基因survivin 蛋白的表达;转染非特异对照组pshRNA?negative的细胞绿色荧光仍较强,明显强于pshRNA?survivin 作用组,表明非特异对照组pshRNA?negative 不能抑制survivin 基因蛋白的表达,验证了pshRNA?survivin 作用的特异性。

    2.3半定量RT?PCR

    琼脂糖凝胶电泳结果表明，见图3。6 组泳道中细胞内源GAPDH 基因片段条带的亮度强弱相似,说明RT?PCR 中加入模板的量一致,而扩增的survivin基因电泳带存在明显差异。其中转染脂质体、质粒pGE?1和非特异对照质粒pshRNA?negative的扩增survivin PCR带亮度较强,而转染重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2的扩增survivin PCR带亮度明显减弱,三者之间无明显差异,证实了2种重组质粒pshRNA?survivin 在mRNA 水平上抑制survivin基因的mRNA转录,非特异对照质粒pshRNA?negative对目的survivin 基因的mRNA没有抑制作用,提示siRNA 抑制目的基因转录的特异性。ImageMaster Total Lab 图像系统分析结果显示,以转染脂质体的RT?PCR 为标准(亮度定为100),其他几组与之比较,其中细胞内源GAPDH基因片段条带亮度相近,转染质粒pGE? 1非特异对照质粒pshRNA?negative、pshRNA?survivin?1、pshRNA?survivin?2的mRNA 被siRNA 沉寂率分别是转染脂质体对照组的14.40%、19.73%、80.60%、70.09%。

    2.4细胞凋亡检测

    结果表明，见图4,转染脂质体、质粒pGE? 1和非特异对照质粒pshRNA?negative组的YTMLC细胞凋亡率分别为（0.41±0.08）%，（1.91±0.15）%,（4.98±0.29）%,而转染重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2的凋亡率分别为（33.42±2.42）%（t=6.33,P<0.01）和（20.09±1.32）%（t=5.45,P<0.01）。说明构建的pshRNA?survivin?1 和pshRNA?survivin?2 两种siRNA 均能在肿瘤细胞中明显促进YTMLC细胞的凋亡;转染非特异对照组pshRNA?negative的细胞无明显YTMLC细胞凋亡增加,表明非特异对照组pshRNA?negative 不能促进YTMLC细胞的凋亡,验证了pshRNA?survivin 作用的特异性。

    3讨论

    凋亡抑制因子survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAP) 家族新成员,survivin具有高度保守性和调节细胞分化、抑制凋亡的功能。研究发现，与其他的IAP蛋白相比，生存素有许多独特的特点，其组织分布有明显特征性,它在除胎盘、胸腺和生殖腺外的成人终末分化组织及癌旁组织一般无表达，而当细胞发生转化或恶性变时又重新表达，包括肝癌、肺癌等大多数恶性肿瘤中呈高表达。另外它在癌组织中的表达是一个渐进的过程，随着癌前细胞向癌细胞的转化，survivin的表达逐渐升高。在结肠癌、直肠癌、乳腺癌、

    （A）: Only Lipofectamine ; （B） : pGE? 1;（C）: pshRNA?negative ; ( D): pshRNA?survivin?1 ; (E)  : pshRNA?survivin?2

    图4流式细胞术检测转染重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2后促进YTMLC细胞凋亡的作用

    非小细胞肺癌、胃癌以及神经母细胞瘤的研究提示survivin的表达可以作为预后不良的标志。有证据显示survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子之一，抑制肿瘤细胞survivin的功能可以促进肿瘤细胞凋亡而起到肿瘤的作用。研究证明：survivin在肿瘤组织的高表达和表达的特异性，在100多种肿瘤特异性表达基因中,其表达特异性名列第3。这种选择性表达以及它与EPR?1和bcl?2分子的特殊关系，使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点[1,2] 。

    研究表明,人工合成的survivin反义寡核苷酸、反义RNA、核酶和负显性突变体导入肿瘤细胞内能抑制survivin 基因的表达,促进肿瘤细胞凋亡[4?7] 。RNA干扰(RNAi) 是界生物体的一种遗传现象,其主要是利用双链RNA 特异性介导其互补同源mRNA 序列的降解,从而特异性抑制目的蛋白的表达,抑制作用强[8]。研究发现RNAi 抑制目的基因的作用强于反义寡核苷酸[9] 。近年来广泛应用的RNA干扰技术(RNA interference,RNAi),RNAi的技术优势包括：RNAi基因的抑制效果确切，抑制具有严格的序列特异性，治疗的针对性强，以及其具有级联放大效应和高穿透性更适合于恶性肿瘤的实验研究，因此，RNAi技术在肿瘤的基因治疗上具有光明的应用前景。自发现以来,已广泛应用于基因功能、肿瘤和病毒性疾病等的研究。Kappler等[10]应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)降低五种分别具有野生型及突变的p53基因的肉瘤细胞的survivin的表达,其结果提示不论肉瘤细胞是否表达野生型p53基因,靶向survivin的siRNA可以将其特异性地杀灭。Williams等[11]研究发现,无论是体外的结肠癌细胞HCT116还是体内的HCT116异种移植物,应用RNAi技术阻断survivin表达可显著抑制其生长。

    本研究是在已构建针对survivin 基因的siRNA 的基础上,观察其特异性抑制内源目的基因survivin 的作用。从结果上看,重组质粒pshRNA?survivin?1和 pshRNA?survivin?2不仅能明显抑制目的基因survivin 的表达以及mRNA 的转录水平,抑制作用分别达80.60%和70.09%以上,而且非特异对照质粒pshRNA?negative对survivin 基因无抑制作用,表明重组质粒pshRNA?survivin?1 和pshRNA?survivin?2具有特异性抑制目的基因的作用。重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2的凋亡率分别为（33.42±2.42）%和（20.09±1.32）%。说明构建的pshRNA?survivin?1 和pshRNA?survivin?2 两种siRNA 均能明显促进云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞的凋亡;转染非特异对照组pshRNA?negative的细胞无明显凋亡增加,表明非特异对照组pshRNA?negative 不能促进YTMLC细胞的凋亡,验证了pshRNA?survivin 作用的特异性。总之，本实验结果表明重组质粒pshRNA?survivin?1和pshRNA?survivin?2 均可明显抑制YTMLC细胞内源survivin 的表达和mRNA 的转录并均可明显促进YTMLC细胞的凋亡,为survivin 介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础，特别是为云南肺癌的治疗带来了新思路。

    由于本实验利用DNA载体在细胞内转录mRNA而发挥作用，克服了合成RNA成本高、费用大的缺点，更利于RNAi技术的推广利用。但本研究，在survivin靶序列的选择方面没有进行更进一步的尝试，所以今后应加强优选靶序列及其生物学效应的比较。RNA干扰技术运用于肿瘤治疗的研究才刚刚起步，但已表现出巨大的潜力，或会成为肿瘤治疗的新希望。

【】

［1］ Lu B,Mu Y,Cao C,et al.Survivin as a therapeutic target for radiation sensitization in lung cancer［J］.Cancer Res,2004,64(8) :2840 ? 2845.

[2]Emens LA.Survivin and cancer［J］.Cancer Biol Ther,2004,3(2) :180 ?183.

[3]Tuschl T.Expanding small RNA interference［J］.Nat Biotechnol,2002,20(5) :446?448.

[4]Tong QS,Zheng LD,Chen FM,et al.Selection of optimal antisense accessible sites of survivin and its application in treatment of gastric cancer［J］.World J Gastroenterol,2005,11(5):634?640.

[5]Dai DJ,Lu CD,Lai RY,et al.Survivin antisense compound inhibits proliferation and promotes apoptosis in liver cancer cells［J］.World J Gastroenterol,2005,11(2):193?199.

[6]Pennati M,Binda M,De Cesare M,et al.Ribozyme mediated down regulation of survivin expression sensitizes human melanoma cells totopotecan in vitro and in vivo［J］.Car Cinogenesis,2004,25(7):1129?1136.

[7]Fornaro M,Plescia J,Chheang S,et al.Fibronectin protects prostate cancer cells from tumor necrosis factor alpha induced apoptosis via the AKT/survivin pathway［J］.J Biol Chem,2003,278(50):50402?50411.

[8]McManus MT,Sharp P A.Gene silencing in mammals by small interfering RNAs［J］.Nature Rev Genet,2002,3(10):737?747.

[9]Aoki Y,Cioca DP,Oidaira H,et al.RNA interference may be more potent than antisense RNA in human cancer cell lines［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol,2003,30(1?2):96?102.

[10]Kappler M,Bache M,Bartel F,et al.Knockdown of survivin expression by small interfering RNA reduced the clono genic survivial of human sarcoma cell lines independently of p53［J］.Cancer Gene Ther,2004,11(3):186?193.

[11]Williams NS,Gaynor RB,Scoggin S,et al.Identification and validation of genes involved in the pathogenesis of colorectal cancer using cDNA microarrays and RNA interference［J］.Clin Cancer Res,2003,9(3):931?946.