宫颈腺癌中HPV16/18感染与COX?2蛋白表达的关系

              作者：王喜梅, 李树平,舒筱灿，吴勇军,孙 雷,郑仁恕，湛丽

【摘要】  　　目的 探讨16、18型人乳头瘤病毒（HPV16/18）在宫颈腺癌发生中的作用，分析HPV16/18感染与环氧化酶?2（COX?2）蛋白表达的关系。方法 采用组织微阵列技术结合原位杂交和免疫组化(SP法)检测24例慢性宫颈炎和86例宫颈腺癌HPV16/18 DNA和COX?2蛋白表达情况。结果 HPV16/18 DNA和COX?2蛋白在宫颈腺癌中的阳性表达率分别为65.1%与86.0%，均显著高于慢性宫颈炎组织8.3%与33.3%（P<0.01）。HPV16/18感染与宫颈腺癌的病理分级和组织学类型无关，但与COX?2表达呈正相关（P<0.05）。COX?2表达与宫颈腺癌的病理分级有关， G3组COX?2蛋白阳性表达率明显高于G1组（P<0.05）。COX?2表达与宫颈腺癌组织学类型无明显相关性（P＞0.05）。结论 宫颈腺癌的发生与HPV16/18感染及COX?2蛋白表达异常相关，宫颈腺癌中COX?2高表达与HPV16/18感染有一定相关性，二者可能协同作用导致宫颈腺癌恶性发展。

【关键词】  宫颈腺癌　HPV16/18　COX?2　原位杂交；免疫组化

　　The Relationship between HPV16/18 Infection and COX?2 Protein Expression in Cervical Adenocarcinoma

          Key words：Cervical adenocarcinoma;HPV16/18;COX?2;In situ hybridization;Immunohistochemistry

　人乳头瘤病毒（Human papilloma virus,HPV）感染已被公认为是宫颈癌的主要病因，人宫颈癌细胞中表达的HPV瘤基因涉及宫颈上皮的转化和永生，且为增生性病变向恶性演进所必需。与宫颈肿瘤相关的HPV有20余种，其中HPV16/18在宫颈腺癌的检出率明显高于其他类型。环氧化酶?2 (Cyclooxygenase?2,COX?2)是一种诱导型酶，可在多种因子刺激下产生，它与多种肿瘤的细胞增殖、抗细胞凋亡和肿瘤血管形成等密切相关。我们通过自制组织微阵列对24例慢性宫颈炎和86例宫颈腺癌组织进行原位杂交和免疫组化检测，探讨HPV16/18DNA与COX?2蛋白表达在宫颈腺癌发生发展中的作用，分析HPV16/18感染与COX?2蛋白表达的关系。

    1资料与方法

    1.1临床资料

    选取大连市妇产病理科、大连医科大学病理中心及湖南省肿瘤医院病理科1999～2004年保存的宫颈腺癌石蜡标本86例，患者年龄25～72岁，平均52.1岁，全部病例均经病理专家复诊证实并按《诊断外科病》标准[1]进行组织学分类和病理分级。组织学类型：宫颈内膜型腺癌52例，子宫内膜样腺癌13例，透明细胞腺癌18例，浆液性乳头状腺癌3例。病理分级：G1 31例，G2 33例，G3 22例。另取24例慢性宫颈炎组织作为正常对照。所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋。

    1.2组织微阵列制作

    参照王喜梅等[2]制作方法自制组织微阵列，主要步骤：① 用自制打孔针在包埋盒内进行手工单孔制胚，根据实验标本量排成8×6孔数的长方形阵列。② 显微镜下观察HE片并在供体石蜡标本上准确圈出取材部位。③ 用自制取材针在供体蜡块上钻取深约2～3mm的组织条植入已打孔的受体蜡模，置（52±1）℃烤箱内连续烘烤2～3h，使供体组织条与受体蜡模完全融为一体，见图1。④ 将已制备好的组织微阵列连续4μm厚切片，贴片后于37℃恒温箱中放置12h，常温保存备用。

    1.3原位杂交

    HPV16/18原位杂交检测试剂盒（含生物素标记的HPV16/18探针）购自福建泰普生物有限公司。杂交/检测主要步骤：切片脱蜡水化；加蛋白酶K，37℃孵育18min；梯度酒精脱水；每张切片加入10μl的生物素化探针，并盖上盖玻片；95℃变性10 min；37℃下湿盒中杂交10h；去垢剂洗涤液浸片15min去盖玻片；加SP?AP结合物，37℃孵育25 min；加酶底物BCIP/NBT室温暗盒显色15 min；核固红复染；水性封片剂封片。

    1.4免疫组化标记

    免疫组化染色采用SP法。羊抗人COX?2单克隆抗体购自北京中杉生物技术有限公司。SP免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司，染色步骤参照试剂盒说明书进行。以已知阳性片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

    1.5结果判断

    HPV16/18 DNA和COX?2蛋白阳性细胞的计数限为宫颈腺癌组织中的肿瘤细胞和慢性宫颈炎组织中具有正常宫颈腺上皮形态特征的细胞。原位杂交以细胞核出现蓝色或黑色颗粒为阳性标记，阳性细胞数＞5%为阳性(+)。免疫组化以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性标志，阳性表达根据阳性细胞百分数和着色程度进行半定量结果判定：无阳性细胞0分，阳性细胞数≤25%记1分， 26%～50%记2分， 51%～75%记3分，≥76%记4分；胞质无着色0分，棕黄1分，棕色2分，棕褐3分；每张切片以两项得分乘积为准：0分阴性(?)，1～4分阳性(+)，4分以上强阳性(++)。所有结果均用双盲法测定。

    1.6统计学处理

    采用SPSS11.0统计软件进行统计学分析，率的比较用χ2检验或四格表确切概率检验，两者相关性用非参数Spearman等级相关分析，P<0.05为显著性检验水准。

    2结果

    2.1不同宫颈组织HPV16/18感染和COX?2蛋白表达

    HPV16/18 DNA阳性细胞表现为核中出现蓝色或黑色颗粒，见图2。86例宫颈腺癌中HPV16/18DNA阳性表达率为65.1%（56/86），明显高于慢性宫颈炎组织8.3%（2/24），差异具显著性（P<0.01）。COX?2蛋白阳性细胞表现为细胞质中出现棕黄色颗粒，见图3。86例宫颈腺癌组织，COX?2蛋白阳性表达率为86.0%（74/86），明显高于慢性宫颈炎组织33.3%(8/24),差异具显著性（P<0.01）。HPV16/18DNA与COX?2蛋白阳性表达的癌细胞在宫颈腺癌组织中呈弥漫性或灶性分布，间质细胞出现少量阳性表达。在慢性宫颈炎组织中，间质细胞仅少量出现HPV16/18DNA阳性表达，而在增生、化生的宫颈腺上皮细胞中HPV16/18 DNA阳性表达较明显。COX?2蛋白表达在慢性宫颈炎组织中主要位于宫颈腺上皮细胞，间质细胞阳性表达不明显。

    2.2宫颈腺癌不同病理分级和组织学类型中的HPV16/18感染和COX?2蛋白表达

    HPV16/18 DNA在宫颈腺癌不同病理分级和组织学类型中的阳性表达率略有差异，但无统计学意义（P均>0.05）。COX?2在宫颈腺癌中的蛋白表达随肿瘤恶性程度的增加而增强，G3组阳性表达率均明显高于G1组（P<0.05）。COX?2在透明细胞腺癌和宫颈内膜型腺癌中的表达较高，但与子宫内膜样腺癌比较，差异无显著性（P>0.05），见表1。表1宫颈腺癌不同病理分级和组织学类型中的HPV16/18感染和COX?2蛋白阳性表达注： G3组与G1组比较，* P<0.052.3宫颈腺癌中HPV16/18感染与COX?2蛋白表达关系

    56例HPV16/18DNA阳性表达的宫颈腺癌组织COX?2蛋白强阳性表达率较高46.32%（26/56），阴性表达率仅为10.7%（6/56）；30例HPV16/18DNA阴性表达的宫颈腺癌组织COX?2蛋白强阳性表达率较低20.0%（6/30），而阴性表达率相对较高20.0%（6/30）。 相关分析也证实， HPV16/18DNA表达与COX?2蛋白表达之间呈明显正相关（相关系数r为0.259，P<0.05）。

    3讨论

    HPV是一种微小的DNA病毒，其分子为高度螺旋化的双链环状，由大约8 000bp组成，可编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等病毒蛋白。迄今为止世界上已发现的HPV有100多种，其中20余种已证实与宫颈肿瘤相关[3]。HPV感染导致宫颈肿瘤恶变发生的机制主要涉及细胞周期与细胞凋亡，目前研究证实高危型HPV16/18在宫颈癌的检出率明显高于其他类型。本实验通过自制组织微阵列将宫颈腺癌和慢性宫颈炎组织集成到载玻片上进行原位杂交检测，发现86例宫颈腺癌组织中HPV16/18DNA阳性表达率为65.1%，与An 等[4]的实验普查结果近似；比较宫颈腺癌与慢性宫颈炎组织，前者HPV16/18DNA阳性表达率明显高于后者（P<0.01），说明宫颈腺癌的发生与高危型HPV16/18感染密切相关。当HPV16/18感染宫颈时，可将自身DNA整合到宿主细胞基因组中，进入宿主细胞基因组中的病毒DNA上含有完整的E6、E7癌基因，其表达的E6、E7原癌蛋白能使宿主细胞中原癌基因激活，抑癌基因失活，从而影响相关蛋白表达，导致细胞增殖失控，细胞凋亡异常，破坏正常细胞周期调控，使宫颈上皮发生恶性转化。Shyu等[5]报道，HPV16/18感染与宫颈腺癌的临床分期有关，但本研究未发现HPV16/18DNA与宫颈腺癌的病理分级和组织学类型有关，这可能是由于不同实验室选用的研究对象不同和标本数量不一所致，且宫颈癌的发生是多基因调控、多步骤、多因素综合作用的结果。

    本实验中，我们同时对自制宫颈腺癌和慢性宫颈炎组织微阵列进行COX?2蛋白的免疫组化研究。COX?2是一种诱导型酶，可在多种因子刺激下产生，它与多种肿瘤发生密切相关。目前关于COX?2的作用机理尚未明确，其可能的致癌机制主要涉及细胞的增殖和凋亡，同时与基质降解、血管形成、免疫抑制及致癌物的代谢等有关。有报道证实[6，7]， COX?2过表达可通过合成大量的PGS加速肿瘤细胞增殖、上调bcl?2和下调E?cadherin、TGF?β受体表达抑制肿瘤细胞凋亡、刺激MMP?2分泌使基质降解、上调EGF、VEGF促进肿瘤血管形成等促进肿瘤的发生和发展。现已在多种人类肿瘤（如乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、甲状腺乳头状癌等）组织中发现COX?2表达显著增高，且多与肿瘤组织病理分级和临床分期相关[8，9]。本研究结果显示，86例宫颈腺癌组织，COX?2蛋白阳性表达率为86.1%，与Chen等[10]报道基本一致，比较宫颈腺癌与慢性宫颈炎组织，前者COX?2蛋白阳性表达率明显高于后者（P<0.01），说明COX?2高表达与宫颈腺癌的癌变发生有关，COX?2可作为宫颈腺癌恶性化的分子指标。同时免疫组化结果显示随宫颈腺癌恶性程度的增加COX?2阳性表达率不断增高，病理分级G3组COX?2阳性表达率明显高于G1组（P<0.05），提示COX?2蛋白表达增高可能促进宫颈腺癌恶性发展。

    子宫颈肿瘤的癌变发生是多基因调控、多因素综合作用的结果。许多研究证实，宫颈上皮的HPV感染往往导致癌基因（如PIK3CA、erbB2、c?myc等）的激活和抑癌基因（如p53、pRb、p27等）的失活，同时HPV感染可诱导凋亡抑制基因bcl?2活性升高和凋亡促进基因bax活性降低，最终多因素协同作用破坏正常细胞周期调控，促成宫颈腺癌癌变发生和恶性发展[11,12]。本文通过对HPV16/18DNA的原位杂交和COX?2蛋白的免疫组化检测发现，在HPV16/18DNA极低表达的慢性宫颈炎组织中COX?2蛋白表达较低；在HPV16/18DNA高表达的宫颈腺癌组织中COX?2也出现高表达，提示宫颈腺癌中HPV16/18感染可能促进COX?2蛋白表达上调。同时相关分析证实，86例宫颈腺癌组织中HPV16/18DNA与COX?2蛋白表达之间呈明显正相关（P<0.01），提示宫颈腺癌中HPV16/18感染可能激活COX?2基因，使COX?2蛋白表达显著增加，细胞出现过度增殖并不断朝着恶性发展。

【】
 ［1］ Stephen S.Sternberg主编,回允中主译.诊断外科病［M］.第3版.北京：北京大学医学出版社,2003.2186?2192.

［2］王喜梅，孙雷，柳洁，等.组织微阵列的简易制作及应用[J].肿瘤防治研究，2005，32（7）：452.

［3］ Segawa T,Sasagawa T,Yamazaki H,et al.Fragile histidine triad transcription abnormalities and human papillomavirus E6?E7 mRNA expression in the development of cervical carcinoma[J].Cancer,1999,85(9):2001?2010．

［4］ An HJ,Kim KR,Kim IS,et al.Prevalence of human papillomavirus DNA in various histological subtypes of cervical adenocarcinoma: a population?based study[J].Mod Pathol,2005,18(4):528?534．

［5］ Shyu JS,Chen CJ,Chiu CC,et al.Correlation of human papillomavirus 16 and 18 with cervical neoplasia in histological typing and clinical stage in Taiwan: an in?situ polymerase chain reaction approach[J].Surg Oncol,2001,78(2): 101?109．

［6］ Ryo O,Keigo Y, Takeshi F,et al.Depth of invasion parallels increased cyclooxygenase?2 levels in patients with gastric carcinoma［J］.Cancer,2001,91(10):1876?1881．

［7］ Prescott SM,White RL.Self?promotion? Intimate connections between APC and prostaglandins H synthase?2［J］.Cell,1996,87(5):783?786．

［8］ Sivula A,Talvensaari?Mattila A,Lundin J,et al.Association of cyclooxygenase?2 and matrix metalloproteinase?2 expression in human breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2005,89(3):215?220．

［9］ 王喜梅,孙雷,张朝，等.EGFR、COX?2及p63蛋白表达与甲状腺乳头状癌侵袭转移的关系[J].临床与实验病理学杂志，2004，20（2）：191?194．

［10］Chen YJ, Wang LS,Wang PH, et al. High cyclooxygenase?2 expression in cervical adenocarcinomas［J］.Gynicol Oncol,2003,88(3):379?385．

［１1］Zhang A,Maner S,Betz R,et al.Genetic alterations in cervical carcinomas: frequent low?level amplifications of oncogenes are associated with human papillomavirus infection[J].Int J Cancer,2002,101(5):427?433.

［12］Ip SM,Huang TG,Yeung WS,et al.pRb?expressing adenovirus Ad5?Rb attenuates the p53?induced apoptosis in cervical cancer cell lines[J].Eur J Cancer,2001,37(18):2475?2483.