用real?time RT?PCR技术检测肺癌淋巴结的隐匿性微小转移

【摘要】  目的 评价一种简单客观敏感的检测淋巴结中扩散的肿瘤细胞方法：real?time RT?PCR。方法 从手术的30例非小细胞肺癌病人获得纵隔淋巴结100组，分别进行常规病检查和real?time RT?PCR检测CK19 mRNA的表达。从12例手术的非癌症病人获得纵隔淋巴结18组作为正常对照，用15例肺癌病人原发肿瘤组织作为阳性对照。结果 在94(94.0%)组经组织病理学检查未发现肿瘤细胞的淋巴结中，用real?time RT?PCR在26(27.7%)组检测到CK19 mRNA的表达。6组经组织病理学检查有肿瘤细胞扩散的淋巴结中全部检测到CK19 mRNA的表达。组织病理学检查22例病人为pN0期，用real?time PCR方法在这些病人中发现13(59.1%)例病人淋巴结有微小扩散的肿瘤细胞。结论 应用real time RT?PCR检测CK19 mRNA的表达是一种在纵隔淋巴结发现扩散肿瘤细胞敏感而特异的方法。

【关键词】  肺癌 隐匿性微小转移 real?time RT?PCR 角质蛋白19

   0  引言

    在经手术完全切除肿瘤的肺癌病人中，约有40%手术后两年内复发，五年的生存率仅为60%左右[1]，复发的主要原因是残留的微小转移的癌细胞不能用常规的组织病理学方法发现。

    本研究使用LightCycler系统用real?time RT?PCR方法检测角质蛋白19(Cytokeratin CK19) 基因在非小细胞肺癌病人局部淋巴结的表达，研究肺癌纵隔淋巴结微小转移的诊断，评价real?time RT?PCR方法在检测淋巴结中扩散的肿瘤细胞的敏感性和特异性。

    1  材料和方法

    1.1  研究的标本

    实验组：从手术的30例NSCLC病人获得纵隔淋巴结100组，分别进行常规的病理学检查和real?time RT?PCR检测CK19 mRNA的表达。

    对照组：①从12例手术的非癌症病人获得纵隔淋巴结18组作为正常对照； ②用15例非小细胞肺癌病人原发肿瘤组织作为阳性对照，观察CK19 mRNA的表达。

    在手术中获得的淋巴结和肿瘤组织立即放入RNA稳定溶液，储存在-20℃冰箱中。

    1.2  Cytokeratin 19( CK19) 基因的检测

    1.2.1  RNA的提取  提取总RNA所用试剂盒为RNeasy Midi Kit,QIAGEN。

    将淋巴结(重量30～250mg) 放入液氮中速冻。在预冷的容器中研磨成细粉末，转移至15ml的试管中。加入4ml提取缓冲液RLT，涡旋混匀。根据试剂盒的说明进行操作，提取总RNA。用Biophotometer仪测定RNA浓度。用无RNase水校正零点。

    1.2.2  肺癌细胞A549培养与RNA提取

    本研究选用NSCLC 细胞系A549。用RPMI1640加5%～10%小牛血清培养A549细胞，收集总数为5×106的细胞进行RNA提取，步骤同淋巴结的RNA提取。

    1.2.3  c?DNA合成  所用试剂盒为1st strand cDNA synthesis kit for RT?PCR (AMV)+, Roche。在20μl的反应体系中含组织RNA 500ng，10X反应缓冲液2.0μl，随机引物p(dN)6 2.5μl，dNTPs混合液2.0μl，AMV反转录酶1.0μl，25mmol/L MgCl2  2.5μl。先将RNA变性：65℃，15min。然后加入反应混合物溶液，设定PCR仪(带热盖的自动化热循环反应仪)程序：25℃保温10min, 42℃反应1h, 95℃处理5min以变性反转录酶，然后在4℃保存1～2h或在-20℃长期保存备用。同时设阳性对照：肺癌细胞A549，阴性对照为水。

    1.2.4  real time PCR  所用的引物为Cytokeratin19 (CK19), 基因为Cyclophilin B (CPB)，所用试剂盒为LightCycler?CK19 quantification kit, LightCycler?CPB quantification kit。LightCycler faststart DNA master SYBR green 1 kit( Search GmbH公司，Heidelberg, 德国)。

    ①建立反应体系，在无菌离心管中加入以下反应成分，见表1。

    ②real time PCR反应： 使用LightCyclerTM PCR表1  PCR反应混合物溶液

    反应物体积（μl）  PCR等级水12.0LC 引物2.0LC DNA Master Sybr?Green I2.0模板4.0总体积20.0

    仪， 设定程序： 变性： 95℃ 10min， 延伸 95℃ 10s,68℃ 10s,72℃ 16s, 40个循环。PCR结束后自动进入熔点曲线分析：95℃ 0s,58℃10s,95℃  0s。退火：40℃ 30s。

    ③标准曲线：相对定量分析：将A549肺癌细胞的RNA分别配成浓度为500ng/μl, 100ng/μl, 20ng/μl, 4ng/μl, 0.8ng/μl，合成cDNA, 用引物Cytokeratin19 (CK19), Cyclophilin B (CPB)， 进行real time PCR反应，用LightCycler分析软件产生标准曲线。

    ④数据分析: 使用LightCycler相对定量分析软件进行数据分析。

    CK19 mRNA的表达用相对率来表示：

    CK19浓度(病人) /CPB浓度 (病人)CK19浓度(A549) /CPB浓度 (A549)

    2  结果

    2.1  病人的临床和病理特征  实验组淋巴结取自30例NSCLC病人，其中经病理常规检查证实Ⅰ期肺癌22例，Ⅱ期5例，Ⅲ期3例。鳞癌16例，腺癌9例，大细胞癌5例。

    2.2  淋巴结的病理特征  阴性对照组18组淋巴结取自12例病人，手术后病理证实为非肺癌疾病。阳性对照组共15组标本取自15例病人，病理学分类：鳞癌7组，腺癌5组，大细胞癌3组。实验组淋巴结共100组，取自30例NSCLC病人，经病理学证实未发现肿瘤细胞94组，发现有肿瘤细胞转移的为6组。

    2.3  阴性对照组CK19的表达  全部淋巴结都有低水平的CK19mRNA的表达（均检测到CK19基因转录水平扩增产物的荧光谱），相对率的最高值为1.79×10-1。相对率的最高值将作为界值来分析实验组的CK19 mRNA的阳性表达。

    2.4  阳性对照组CK19的表达  只有1个大细胞癌标本CK19表达的相对率低于1.79×10-1 (阴性对照组CK19相对率的最高值)。CK19 mRNA表达的阳性率为93.3%。

    2.5  实验组病人的淋巴结CK19的表达(表2)  100例淋巴结中CK19阳性表达率为32.0%, 其中鳞癌占35.6%，腺癌占29.7%，大细胞癌占27.8%。病理学证实发现有肿瘤细胞转移的6组淋巴结全部表达CK19。病理学检查为阴性的94组淋巴结表达CK19 mRNA的有26组，阳性率为27.7%。表2  实验组病人的淋巴结CK19的表达

    组织学分类CK19 阴性CK19 阳性鳞癌29(64.4%)16 (35.6%)腺癌26 (70.3%)11 (29.7%)大细胞癌13 (72.2%)5 (27.8%)阳性淋巴结06 (100.0%)阴性淋巴结68(72.3%)26(27.7%)合计68(68.0%)32(32.0%)

    2.6  根据CK19的表达NSCLC病人的分子生物学分期  根据CK19的表达，病人的N?Stage发生明显变化。22例N0期病人有13例(59.1%)上调为N1～2期，5例N1期病人中1例上调为N2期，3例N2期病人病理证实无癌细胞扩散的淋巴结CK19 mRNA的表达均为阳性。

    2.7  统计学分析  使用SPSS软件用χ2检验对CK19 mRNA的表达与组织学类型，肿瘤的大小和淋巴结的分期进行分析，结果显示P>0.05, 表明不同的组织学类型，肿瘤的大小和淋巴结的分期与CK19的表达无显著性差异。

    3  讨论

    通常微小转移是指肿瘤细胞扩散的一种形式，这样小数量扩散的肿瘤细胞用常规检测方法不能发现，需用非常敏感的方法才能检测到[2]。病人在原发肿瘤完全切除后的数月或数年肿瘤复发，说明局部扩散的肿瘤细胞在术前就已存在，或有转移的潜在能力。

    很多研究应用免疫组化方法，检出的阳性率有明显差异（4%～71%）[3?6]，原因可能是由于抗CK抗体与淋巴结中的网状细胞有交叉反应[7?8]，另外形态学标准的判断有主观因素存在。

    real?time PCR是一种封闭式定量PCR扩增系统，能在短时间内对DNA分子进行扩增的，并可快速准确对DNA分子直接作定量的数据读取和分析，具有高敏感性和高精确度，能同时测定很多样本，立刻提供动态的PCR资料，省去了传统的电泳照相等操作步骤，也避免操作过程的繁琐，使交叉污染减少到最低。

    CK19是一种单层上皮的特异性细胞骨架结构，是上皮角质蛋白家族中分子量最低的角质蛋白，几乎所有的单层上皮都表达CK19。CK19在肺癌中有丰富的表达，CK19在腺癌中的表达为90.3%，在鳞癌的表达为86.7%～95%[9,10]，CK19在大细胞肺癌的表达较低，为30%[11]。

    本研究中将A549肺癌细胞10个、100个、1000个分别加入到5×106淋巴细胞(从正常人外周血中分离)中，用real?time RT?PCR反应检测CK19基因转录水平扩增产物的荧光谱,可以在5×106背景淋巴细胞中检测到10个A549肺癌细胞。在原发肺癌的组织中，CK19 mRNA表达的阳性率达到93.3%。在6组阳性淋巴结中，全部表达CK19 mRNA。因此将CK19作为肿瘤标记物采用real?time PCR方法检测肺癌肿瘤细胞具有非常高的敏感性。

    CK19在正常组织中有低水平表达，本研究的正常对照组中全部淋巴结都有CK19的低水平表达。我们选用其最高值作为分界值来区分癌组织和正常组织对CK19 mRNA的表达[12]，高于这个值为CK19 mRNA表达阳性。

    在实验组的100组淋巴结中，病理证实无肿瘤细胞转移的94组淋巴结有26组淋巴结检测到CK19基因的表达，总阳性率为27.7%。30例病人中有17例病人的淋巴结检测到CK19 mRNA的表达，阳性率为56.7%，其中22例N0期病人有13例检测到CK19 mRNA的表达，阳性率为59.1%。D'Cunha等[13]用real?time PCR方法对53例NSCLC的PN0期病人的232个淋巴结检测CEA的mRNA的表达以发现微小转移的肿瘤细胞，淋巴结的阳性率为25.4%(59/232)，病人阳性率为56.6% (30/53)。我们的研究结果与D'Cunha等结果相近，尽管所用的肿瘤标记物不同。

    一些学者的研究表明局部微小转移与病人的预后和生存率密切相关[14,15]。Chen等[14]用免疫组化方法检测I期NSCLC病人淋巴结的微小转移的肿瘤细胞，发现有微小转移的平均生存期为1 977天，而无微小转移的为2 456天。用常规HE染色发现肿瘤细胞的病人平均生存期为927天。本研究中的标本取自2003～2004年间手术的病人，目前尚不能统计病人的生存期及肿瘤的复发情况。

    综上所述，real?time PCR技术在对微小转移的肿瘤细胞检测中，可以准确检测微小残留的肿瘤细胞的基因表达，不仅避免了免疫组化分析中大量的切片工作，长时间的操作，形态学判定标准中人为因素所至的假阳性，还避免RT?PCR中容易造成的污染，是一种快速敏感和高特异性的检测方法。肺癌患者纵隔淋巴结中CK19 mRNA的阳性表达，可以作为判断可能存在局部淋巴结微小转移的指标，为肺癌的临床正确分期提供依据，以指导进一步的。

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