丁酸钠诱导Raji细胞基因表达的变化
作者：张海涛 伍俊 汪亚君 郭黠 冯哲玲 梁念慈 朱振宇 马涧泉
【摘要】 目的分析丁酸钠诱导Raji细胞的基因表达变化，探讨丁酸钠诱导凋亡作用机制。方法限制性显示PCR技术(Restriction Display PCR，RD?PCR)分析基因表达变化，利用互联网提供的GenBank核酸数据库分析比对获得的差异表达序列。结果获得14条差异表达序列，其中6条是对照组高表达序列，8条是实验组高表达序列。结论采用RD?PCR技术可以快速简便地分析药物诱导基因表达变化。分析表达差异的序列发现，丁酸钠可诱导促进细胞凋亡的基因表达，降低肿瘤细胞高表达的基因表达。
【关键词】 限制性显示PCR技术；丁酸钠；凋亡；基因表达
Change of Gene Expression in Raji Cells Induced by Sodium Butyrate
Abstract：Objective This study was designed to analyze the change of gene expression and investigate the mechanism of apoptosis induced by sodium butyrate. MethodsThe change of gene expression was analyzed by Restriction Display PCR （RD?PCR）.The differences expressed sequences were sequenced. Nucleic acid sequences were analyzed by using the GenBank in internet. ResultsFourteen differential expressed sequences were gained， of which 6 high expressed sequences were in control cells and 8 high expressed sequences were induced by sodium butyrate. ConclusionThe change of gene expression induced by drugs could be analyzed by RD?PCR methods quickly and simply. Gene expression that prompted cell apoptosis was upregulated induced by sodium butyrate while Gene expression that was high expression in tumor cells was downregulated.
Key words：Restriction Display PCR； Sodium butyrate； Apoptosis； Gene expression
0引言
Raji细胞是悬浮状态生长的，但我们前期研究发现Raji细胞在丁酸钠的处理下可由悬浮生长状态转变为贴壁生长状态，伴随有细胞凋亡现象的发生[1]。我们研究小组拟通过RD?PCR显示mRNA表达差异来揭示丁酸钠诱导Raji细胞凋亡时基因表达的变化，试图寻找造成细胞发生形态学变化的主要基因，探讨丁酸钠作用的可能机制。
1材料和方法
1.1主要试剂丁酸钠(SB)， 溴化乙锭（Sigma公司）； DNA回收试剂盒（QIA quick Gel Extraction Kit Protocol， 德国QIAGEN公司）； mRNA纯化试剂盒（Omega Bio?tek公司）， 限制性内切酶Sau3AI， DNA连接试剂盒， LA Tag酶， RNasin， T4 DNA 连接酶， dNTP， PMD18?T Vector， JM109细菌（大连宝生物公司）； 丙烯酰胺， N， N’–甲叉双丙烯酰胺， 琼脂粉， 琼脂糖， Tag酶， 低熔点琼脂糖（上海生物工程公司）； 胰蛋白胨， 酵母提取物(英国OXIOD公司)； Tris饱和酚（鼎国生物工程公司）； 逆转录酶， TRIzol试剂， DEPC（Invitrogen公司）； RPMI1640（Gibco公司）； 小牛血清（杭州四季青公司）； 100bp DNA Ladder（Bebco公司）； 氯仿， 异丙醇（国产分析纯）。
1.2细胞培养Raji细胞株(来源于中山大学肿瘤防治中心)以含10%小牛血清的RPMI1640培养液于5% CO2中培养。
1.3细胞mRNA的提取将生长状况良好的Raji细胞接种在6孔培养板中，细胞浓度为1.0×106/ml，加入3mmol/L丁酸钠，37℃、5% CO2培养。总RNA的提取按照Invitrogen公司提供的TRIzol试剂说明书进行操作。最后加30μl DEPC处理水溶解总RNA。参照mRNA纯化试剂盒说明书（Omega Bio?tek公司）操作，从总RNA中纯化mRNA。
1.4从mRNA反转录成为cDNA及双链cDNA末端平滑化 逆转录按照Invitrogen公司的说明书进行逆转录，mRNA约2μg，dNTP 0.5mmol/L，Oligd T15 0.1μmol/L，65℃，5min，加M?MLV 200U和酶反应缓冲液，37℃延伸时间75min。cDNA样品20μl，70℃，10min。加入5μl T4 DNA Polymerase， 5μl 10×T4 DNA Polymerase Buffer，5μl 0.1% BSA，3.5μl 2.5mmol/L dNTP，12.5μl灭菌水，轻柔混匀。37℃反应5min。加入25μl EDTA(pH 8.0) 和25μl 10%的SDS，轻柔混匀，停止反应。加入100μl酚/氯仿溶液，振荡，混匀。10000g离心1min，液相分离，将上层水相转移至另一微量离心管中。加入1/10体积3mol/L NaAc（pH 5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀。-20℃，静置30min。4℃离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1～2次，晾干。
1.5cDNA的酶切cDNA溶于20μl水中，定量后，取大约2 μg进行酶切反应。16U Sau3AI，37℃进行酶切反应，时间不少于2h。
1.6接头与cDNA酶切片段的连接采用PCR引物设计软件Oligo5.0设计两条单链寡核苷酸片段来生成接头，sip：5’pGATCCACACCAGCCAAACCCA3’，SIR: 5’GGTTTGGCTGGTGTG3’。接头生成按如下进行：SIP(500μg/ml in water)20μl，SIR(380μg/ml in water)20μl。混合后，90℃，3.6min→80℃，3.6min→70℃，3.6min→60℃，3.6min→50℃，3.6min→40℃，3.6min→30℃，3.6min→20℃，3.6min→4℃保持。分装后，贮藏于-20℃备用。接头与cDNA酶切片段的连接参照TaKaRaDNA连接试剂盒说明及所提供的试剂，步骤如下：cDNA酶切反应液5μl，接头5μl，SolutionII 10μl，SolutionI 20μl。混合均匀后，于16℃连接，时间不少于1h。
1.7RD?PCR反应用引物设计软件Oligo5.0设计与SIR/SIP接头配套的通用引物U，其序列为GGTTTGGCTGGTGTG。设计的限制性引物是在通用引物的GATC3’ 端分别加上一个碱基A、T、C、G，以下简称为引物A、T、C、G，引物序列如表1。
表1 RD?PCR的限制性引物（略）
将引物A、T、C、G两两组合，共有10组，以接头与cDNA酶切片段的连接产物为模板，进行限制性分组PCR反应，反应条件如下：① 97℃ 2min；②95℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；③ 72℃ 5min；④ 4℃保持。扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶中平行电泳。经EB染色后，在紫外灯下观察实验组与对照组的基因表达差异，参照DNA回收试剂盒说明书回收差异条带。
1.8纯化后PCR产物与载体连接转化测序将纯化的PCR产物与pMD18?T Vector连接，操作按说明书进行：pMD18?T Vector 0.5μl，PCR产物4.5μl，Solution I 5.0μl，16℃连接3h。转化JM109感受态细菌。阳性克隆的挑取、鉴定及扩大培养。目的基因片段由上海博雅公司测序。
1.9生物信息学分析差异片段测序后在因特网上登录NCBI的网址（http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/），通过Advance BLAST程序进行同源性分析。在GeneBank中搜索是否有和所发现的片段同源的基因，同源性比较见实验结果部分。
2结果
2.1RD?PCR 产物聚丙烯酰胺凝胶电泳图，EB染色用引物A、T、C、G两两组合，共有10种组合，分别为AA、AT、AC、AG、TT、TC、TG、CC、CG、GG10 组。对从对照组和实验组的细胞中获得的cDNA 进行限制性分组PCR，扩增产物平行地在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经EB染色后，如图1。聚丙烯酰胺凝胶电泳，偶数泳道为对照组，奇数泳道为实验组，可明显看出平行的两组基因表达方面的差异。
2.2差异片段的测序与生物信息分析结果差异片段的测序在上海博雅公司进行。测序生物信息分析结果，见表2。
1：标准分子量；2：AA组（对照组）；3 ：AA组（实验组）；4：AT组（对照组）；5：AT组（实验组）；6：AC组（对照组）；7：AC组（实验组）；8：AG组（对照组）；9：AG组（实验组）；10：TT组（对照组）；11：TT组（实验组）；12：TC组（对照组）；13：TC组（实验组）；14：TG组（对照组）；15：TG组（实验组）；16：CC组（对照组）；17：CC组（实验组）；18：CG组（对照组）；19：CG组（实验组）；20：GG组（对照组）；21：GG组（实验组）
图1RD?PCR电泳图（略）
3讨论
RD?PCR技术[2]的思路是在获得反转录的cDNA之后，进行Sau3AI酶切。Sau3AI 识别位点是四个碱基，理论上平均每256个碱基有一个识别位点。在酶切片段的两端加上由15bp和21bp长的两条互补寡核苷酸单链逐步退火形成的通用接头，接头的一端为4个碱基的粘性端GATC，恰好与选用的Sau3AI的酶切位点互补，另一端为2个碱基的粘性端CA，可以减少片段自身间的串联。酶切片段加上接头之后，用与接头序列配套的限制性引物进行扩增(见表1)。将各引物两两组合，共10组，以接头与cDNA酶切片段的连接物为模板，进行限制性分组PCR反应，各组产物在电泳和染色后，容易观察基因差异表达。
表2差异表达序列的分析结果（略）
现已知丁酸钠可以通过抑制去乙酰化酶改变染色质的构象，导致基因转录的改变。我们研究小组利用RD?PCR来揭示丁酸钠诱导Raji细胞凋亡时基因表达的变化，探讨丁酸钠作用的可能机制。现对获得的差异片断分析讨论。对照组细胞高表达的基因有6条。gi|4504150|ref|NM_002087.1| 是人granulin(GRN)片断。Progranulin和它的水解产物granulin也称畸胎瘤细胞源性生长因子(PC cell?derived growth factor，PCDGF)或epithelin，可刺激细胞增殖，使细胞锚着非依赖性生长。研究表明PCDGF作为一种自分泌生长因子与多种肿瘤，例如乳腺癌、肾上腺癌、神经胶质瘤等的发生、侵袭及细胞存活密切相关[3,4]。gi|5817109|emb|AL110193.1|HSM800843来源于人DKFZp566D143克隆cDNA，尚未见报道其功能。gi|3882182|dbj|AB018274.1|来源于人KIAA0731蛋白编码序列。有文献报道KIAA0731 蛋白在滤泡状甲状腺瘤中表达上调[5]。gi|33466037|gb|AY275537.1| 来源于人线粒体基因序列。尚未见文献报道其功能。gi|188427|gb|J00204.1|HUMMHDRS02来源于人HLA?DR alpha?chain(chain?p34)基因外显子2、3、4和5。文献报道Raji细胞表面HLA?DR抗原表达率为（99.18±0.53）%[6]。gi|15431298|ref|NM_000979.2| 来源于人核糖体蛋白L18(RPL18)的mRNA序列，全长648bp。有研究发现，核糖体蛋白L18的mRNA 在人类结肠癌组织的表达比普通的结肠组织高[7]。实验组高表达的基因序列8条：gi|33466037|gb|AY275537.1|和gi|13272612|gb|AF346967.1|来源于人线粒体基因序列，尚未见文献报道其功能。gi|17065925|emb|AL049795.21|HSDJ622L5与人染色体1p34.2?36.11同源，未见文献报道其功能。gi|37046837|gb|BC058041.1| 来源于人核糖体蛋白L23a的mRNA序列[8]。全长985bp，未见文献报道其功能。 gi|34784771|gb|BC006342.2|来源于人葡萄糖磷酸异构酶mRNA，全长3020bp，与糖代谢有关。gi|10441945|gb|AF218008.1|AF218008来源于人克隆PP3501的mRNA，功能未明，可能与细胞凋亡有关。gi|9966820|ref|NM_020354.1|来源于人溶酶体三磷酸腺苷双磷酸酶类似蛋白1 （apyrase?like protein 1，LALP1)。三磷酸腺苷双磷酸酶可以以Ca2+，Mg2+依赖的方式水解核苷酸三磷酸和二磷酸[9]。gi|4826683|ref|NM_004938.1| 来源于人死亡相关蛋白激酶1（death?associated protein kinase 1，DAPK1)。DAPK是促进细胞凋亡的一种激酶，Raji细胞中该基因由于启动子甲基化而沉默[10]。研究显示，DAPK表达可以抑制肿瘤细胞的恶性表型，促进细胞凋亡[11]。对照组高表达的基因大多与细胞恶性化有关，而实验组高表达的基因中有与细胞分化或凋亡有关的激酶和一些未知功能的基因。丁酸钠处理Raji细胞后，细胞发生凋亡，同时形态学变化很大[1]。上述表达发生变化的基因是否与细胞分化和凋亡相关，并与形态学改变有关呢，需要进一步通过基因异位表达实验验证。
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