白杨素对人胃癌SGC?7901细胞增殖与凋亡的影响

        作者：康颖，刘红光，曾谷清，谷依学

【摘要】  目的探讨白杨素（Chrysin，ChR）诱导人胃癌SGC?7901细胞株凋亡的作用及机制。方法分别用10、20、40、80μM的ChR处理人胃癌细胞株SGC?7901 48h，采用MTT比色法检测ChR对SGC?7901细胞的增殖抑制效应；采用丫啶橙（AO）染色、流式细胞术检测ChR诱导SGC?7901细胞凋亡的发生；应用Western?blot法检测凋亡相关基因NF?κB、Bcl?2、Bax的蛋白表达，并用机图像分析软件进行半定量分析。结果MTT比色法显示的10~80μM的ChR在体外对人胃癌SGC?7901细胞有增殖抑制率为：9.71%~53.64%，该作用呈浓度依赖性；AO染色荧光显微镜观察ChR在体外能诱导人胃癌SGC?7901细胞发生凋亡，出现早期凋亡细胞及凋亡小体；流式细胞术检测结果显示：ChR呈浓度依赖性地诱导SGC?7901细胞凋亡，凋亡率为2.35%~20.8%；Western?blot检测结果显示：凋亡相关基因Bcl?2、NF?κB蛋白表达下调，Bax蛋白表达上调。结论ChR对体外培养人胃癌细胞具有增殖抑制和诱导凋亡作用，呈浓度依赖性。ChR对人胃癌细胞增殖抑制和诱导凋亡作用机制可能与其抑制NF?κB活化、下调 Bcl?2蛋白表达和上调Bax 蛋白表达相关。

【关键词】  胃肿瘤；白杨素； 增殖抑制； 凋亡

　　Chrysin Inhibiting Proliferation and Inducing Apoptosis in Gastric Cancer SGC?7901 Cells

　　　Abstract：Objective To study the  anticancer function and possible mechanism of Chrysin  on gastric cancer cells(SGC?7901).MethodsThe cells of human gastric cancer cell line SGC?7901 was treated respectively with Chrysin at different concentration 10、20、40、80μM for 48h. The proliferation inhibitory rate was measured by MTT assay.  Acridine orange (AO)staining and flow cytometry (FCM) were used  to detect apoptosis. Western blot assay was used to detect the expression of apoptosis related genes NF?κB,Bcl?2,Bax.The semi?quantification of protein expression was analyzed by computer?image?analysis. ResultsWhen compared with control group,  the proliferation could be inhibited by ChR in concentration of 10~80μM,with inhibitory ratios being 9.71%~53.64% (P＜0.05）.The effect increased with concentration. Partial SGC?7901 cells presented characteristic morphological changes of apoptosis which was detected by acridine orange staining. ChR could induce SGC?7901 cells lines apoptosis in dose?dependent manner, The apoptosis rate was 2.35%~20.8%  which was detected by FCM.The protein levels of NF?κB,Bcl?2 were down?regulated, while those of Bax up?regulated. ConclusionChR could restrain the proliferation and induce apoptosis of SGC?7901 in a dose?dependent manner.Inhibition of growth and induction of apoptosis of SGC?7901 cells by ChR is associated with down?regulation of NF?κB and Bcl?2 protein level and up?regulation of Bax protein expression.

　　Key words：Gastric cancer; Chrysin; Proliferation inhibition; Apoptosis

　　0引言

　　白杨素（ChR  5，7－二羟基黄酮）是从紫葳科植物木蝴蝶中提取的一种具有广泛生物活性的黄酮类化合物。近年来，ChR的抗肿瘤作用引起了国内外学者的浓厚兴趣，有研究表明，ChR抑制人急性粒系白血病细胞株（HL60）增殖[1]；诱导人单核白血病细胞株（U937）凋亡[2]。在本实验中，我们用不同浓度的ChR处理人胃癌细胞株SGC?7901，采用MTT比色法、丫啶橙（AO）染色法、流式细胞术等方法检测其对胃癌细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用，应用western?blot法检测凋亡相关基因NF?κB、Bcl?2、Bax的蛋白表达，初步探讨ChR 诱导胃癌细胞凋亡的分子机制。

　　1材料和方法

　　1．1主要试剂白杨素（Chrysin,C16H10F2O4，分子量254溶于醇，不溶于水）购自Sigma 公司，以二甲基亚砜（DMSO）溶解配成1mmol/L母液，闭光保存于4℃冰箱中，临用时将此母液稀释至所需浓度。兔抗人Bcl?2、Bax、NF?κB  p65多克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司，相应二抗和化学发光试剂，均购自NEB公司。MTT、DMSO、AO均购自美国Amresco公司。

　　1．2细胞培养人胃癌细胞株SGC?7901从中南大学湘雅医学院肿瘤研究所引进，培养于含10%灭活小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml 链霉素的RPMI?1640培养液中,在37℃，饱和湿度，5%  CO2培养箱培养，每 2～3天传代。

　　1．3增殖抑制率检测SGC?7901细胞以3×104/ml的浓度接种于96孔板，每孔加入180μl，待细胞贴壁后加20μl不同浓度ChR，使其终浓度分别为10、20、40、80μM，溶媒对照组加入相同体积含终浓度为0.1% DMSO的完全培养基，每组设6个复孔，处理 48h后加入MTT测吸光度值A，计算增殖抑制率，增殖抑制率（%）＝（1－实验组A均值/对照组A均值）×100%，实验重复3次。

　　1．4细胞凋亡检测细胞以3×105/瓶接种，24h后换液同步化，24h后分别用终浓度为10、20、40、80μM的ChR、0.1%的DMSO完全培养基处理48h后，收集细胞，实验重复3次。（1）丫啶橙（AO）染色：以PBS悬浮细胞团，调整细胞浓度为1×106，取出95μl细胞悬液与5μl丫啶橙（100μg/ml）混匀后，涂片后镜检拍照。（2）流式细胞术：预冷的PBS洗涤细胞，用4℃的70%乙醇固定24h后，2000r/min离心，以PBS洗1次，重悬于PBS中加入0.5ml经高温处理的无DNA酶活性的RNaseA，使终浓度为500μg/ml，再加入1ml碘化丙啶 PI（100μg/ml），轻轻混匀，于室温暗处作用15min后，上机检测。

　　1．5Western?blot检测基因表达参照[3]进行细胞蛋白质的提取、定量和分离。转膜后先后与1%脱脂奶粉、一抗、过氧化物酶偶联的二抗孵育，暗室内发光、冲洗胶片。扫描胶片，用计算机图像分析系统测定NF?κB   p65、Bcl?2、Bax蛋白条带密度，实验重复3次。

　　1．6统计学处理采用SPSS11.0统计分析软件, 组间两两比较采用one?way ANOVA 方法进行分析，结果用均数±标准差(±s)表示，量效关系采用双变量相关分析，认为P＜0.05具有统计学意义。

　　2结果

　　2．1MTT检测结果对照组SGC?7901细胞体外生长活跃，经10、20、40、80μM白杨素作用48h后，SGC?7901细胞生长均有不同程度地减慢，增殖抑制率分别为（9.71±0.82）%、（15.46±2.89）%、（32.82±4.18）%、（53.64%±6.42）%，与对照组比较及组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.01 ）。

　　2．2丫啶橙（AO）染色结果对照组细胞形态饱满，细胞质呈绿色，核染色为亮绿色，核形态规则，为圆形或椭圆形；经10、20、40、80μM白杨素作用48h后，部分SGC?7901细胞即发生凋亡的形态学改变，见图1，细胞形态接近正常，胞质为绿色略带橘红色的为早期凋亡细胞，数目随浓度升高有说增加，箭头所指呈现凋亡小体。

　　2．3流式细胞术检测结果小剂量白杨素（10μM）诱导SGC?7901细胞凋亡的作用比较轻微，凋亡率为(2.35±0.66)%，与溶媒对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），随着浓度的升高，凋亡率也增加，20、60、80μM白杨素的诱导凋亡率分别为（5.57±0.96）%、（13.1±1.43）%、（20.8±1.51）%，与溶媒对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。双变量相关分析检测浓度与凋亡率之间存在正相关（r=0.988，P=0.002），即存在量效关系。

　　2．4NF?κB  p65、Bcl?2、Bax蛋白表达经10、20、40、80μM ChR处理SGC?7901细胞48h后，以β?actine为内参，与溶媒对照组比较：NF?κB  p65、 Bcl?2的表达随着ChR浓度的升高而减弱，相关分析分别显示r=-0.920、r=-0.810，差异有统计学意义；而Bax的表达随着ChR浓度的升高而增强，相关分析显示r=0.931，P=0.000，即存在量效关系，见表1、图3。

　　3讨论

　　本研究证明，ChR在一定浓度下，对人胃癌细胞株SGC?7901具有一定的增殖抑制和诱导凋亡作用，该作用具有浓度依赖性。

　　图2流式细胞术检测ChR诱导SGC?7901细胞凋亡率（略）

　　A：溶媒对照组；B?E：分别为10，20，40，80μM ChR处理48h组1~5：依次为溶媒对照组、ChR 10、20、40、80μM处理细胞48h组

　　图3western blot 检测ChR对SGC?7901细胞NF?κB  p65、Bcl?2、Bax蛋白表达的影响（略）

　　表1不同剂量ChR作用SGC?7901细胞48h后NF?κBp65、Bcl?2、Bax的蛋白表达（略）

　　与对照组比较，P<0.05

　　NF?κB是一类关键性的核转录因子，该因子参与多种基因的转录调控，包括细胞因子、细胞周期、细胞分化、细胞放疗、化疗耐药等病理生理过程的调控[4，5]。众多研究表明NF?κB在多种肿瘤上高表达，抑制NF?κB的表达后可促进化疗药物诱导的细胞凋亡[6，7]。有研究表明NF?κB可能通过诱导与上调抗凋亡基因抑制凋亡[8,9]。Bcl?2基因是目前研究最多、最受关注的与细胞凋亡关系密切的基因之一，其表达的蛋白，定位于线粒体膜、核膜及部分内质网膜上，发挥抗凋亡作用。Bax是Bcl?2基因家族中的另一位成员，Bcl?2家族成员通常是以二聚体形式发挥作用，Bcl?2和Bax蛋白形成异源二聚体抑制细胞凋亡，Bax蛋白本身可以形成同源二聚体促进细胞凋亡[10]。因此Bcl?2和Bax的比值是决定凋亡的关键。从本实验的western blot分析结果发现ChR可以下调SGC?7901细胞NF?κB的蛋白表达水平，统计学分析显示：处理组与对照组之间有显著性差异(P<0.05）。结合ChR下调SGC?7901细胞Bcl?2蛋白及上调Bax蛋白的表达水平，我们推测ChR通过抑制NF?κB的活化下调Bcl?2蛋白及上调Bax蛋白的表达水平，使两者比例发生改变，可能是其诱导SGC?7901细胞凋亡的重要分子基础之一。由于细胞凋亡是多基因调控的结果，因此这种作用是否与其他的癌基因和抑癌基因有关，还需进一步的研究探讨。

【】
  　［1］Ting Zhang, Xiaolan Chen, Lingbo Qu. Chrysin and its phosphate ester inhibit cell proliferation and induce apoptosis in Hela cells[J]. Bioorg Med Chem, 2004, 12(23): 6097?6105.

　　[2]Kyung Jin Woo, Jeong Yong?Jin, Park Jong Wook. Chrysin?induced apoptosis is mediated through caspase activation and Akt inactivation in U937 leukemia cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 325(4): 1215?1222.

　　[3]Schattner EJ, Friedman SM, Casali P. Inhibition of Fas?mediated apoptosis by antigen: implications for lymphomagenesis[J]. Autoimmunity, 2002，35(4): 283?289.

　　[4]Sherr CJ.The Pezcoller Lecture: cancer cell cycle revisited[J].Cancer Res, 2000,60(14):3689.

　　[5]Sun SC, Xiao G. Deregulation of NF?kappaB and its upstream kinases in cancer[J]. Cancer Metastasis Rev, 2003,22(4):405?422.

　　[6]Karin M,Cao Y, Greten FR, et al.NF?kappaB in cancer: from innocent by stander to major culprit[J].Nat Rev Cancer,2002,2(4):301?310.

　　[7]Mayo MW,Baldwin AS.The transcription factor NF?kappaB:control of oncogenesis and cancer therapy resistance[J].Biochim Biophys Acta,2000,1470(2):55?62.

　　[8]Kelly M.Regula,Karen Ens,Lorrie A,Kirshenbaum. IKKβIs required for NFкB mediated Bcl?2 activation in ventricular myocytes[J]. Biol Chem, 2002,10(4):1074?1076.

　　[9]Matsushita H，Morishita R,Nata T, et al.Hypoxia?induced endothelial apoptosis through nuclear factor?kB (NF?κB)?mediated bcl?2 suppression[J]. Circulation Research, 2000,86(9):974?981.

　　[10]彭创.Bcl?2和Bax在胆管癌中的表达及相关研究[J].湘南学院学报,2004, 6（4）,59?61.