喉鳞癌组织中SPARC基因的差异表达
作者：车轶群, 王海, 史雪冬，齐军, 郭健, 刘芝华
【摘要】 目的探讨富含半胱氨酸的酸性蛋白(SPARC)在喉鳞癌的增殖、侵润和转移中的作用及指导意义。方法用半定量逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）分析SPARC在不同的喉鳞癌组织和其相邻的正常粘膜组织的差异表达量。利用免疫组化技术研究SPARC在喉鳞癌组织和其相邻的正常粘膜组织的表达差异,同时对蛋白表达进行定位。结果RT?PCR 分析SPARC在20对配对标本中的表达, 在其中16对喉鳞癌组织中的表达明显高于其相应的正常粘膜组织, 在4对中差异表达不明显, R=80.0%(有差异的例数/总例数)。免疫组化技术分析了30对配对喉鳞癌手术标本的石蜡切片(肿瘤组织和正常粘膜组织), 其中25对SPARC蛋白在癌巢细胞中的表达高于相邻的正常粘膜组织, 5例在癌巢细胞中和相邻的正常粘膜组织内表达不明显，R=83.3%。同时对SPARC蛋白在不同分化程度的喉癌组织中的表达进行分析, 发现SPARC在中低分化喉癌中的表达与高分化喉癌无显著差异(P>0.05)。而在有淋巴结转移的喉癌的表达比无淋巴结转移的高（P=0.036）。细胞核和细胞浆均有表达。结论通过mRNA和蛋白水平分析得出，SPARC和喉鳞癌的发生密切相关, 喉鳞癌淋巴结转移时SPARC表达升高。
【关键词】 SPARC； 喉鳞癌； 基因表达； 免疫组化
Department of Clinical Laboratory, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China; Department of Clinical Laboratory, China?Japan Union Hospital of Jilin University;National Center for Clinical Laboratory, Ministry of Health of the PR. China;National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute & Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College
Abstract：Objective To investigate the role of secreted protein, acidic and rich in cysteine (SPARC) in proliferation and metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC). MethodsThe differential gene expression of SPARC between laryngeal squamous cell carcinoma and its corresponding normal laryngeal mucosa from 20 patients was analyzed by semi?quantitative reverse transcription?polymerase chain reaction (RT?PCR). The differential protein expression of SPARC between laryngeal squamous cell carcinoma and its corresponding normal laryngeal mucosa was analyzed by immunohistochemistry (IHC) analysis using well characterized monoclonal antibodies. ResultsThe gene expression of SPARC in LSCC by RT?PCR was higher than that in the corresponding normal laryngeal mucosa (16/20). The expression of SPARC protein was significantly up?regulated in LSCC compared with the corresponding normal laryngeal mucosa in 30 couple cases, not significantly up?regulated in 5 cases. It was not associated with the histological differentiation of LSCC but lymph node metastasis (P<0.05). SPARC located in cytoplasma and nuclei. ConclusionThese findings indicate that SPARC gene may be closely associated with LSCC and it is a tumor?associated gene. The up?regulation of SPARC is marked during the metastasis of LSCC.
Key words：Secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）；Laryngeal squamous cell carcinoma； Gene expression； Immunohistochemistry
0引言
喉鳞癌是喉癌的主要病理类型。医学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室前期通过cDNA微阵列膜对喉鳞癌组织及其配对的相邻正常粘膜组织标本进行分析发现，分泌性富含半胱氨酸(Cys)的酸性蛋白SPARC(Secreted Protein，Acidic and Rich in Cysteine) 在喉鳞癌组织中上调明显[1]。SPARC又称作骨连接蛋白(osteonectin)、基底膜?40(BM?40)、43k蛋白。SPARC由纤维原细胞、成骨细胞、软骨细胞、上皮细胞和血小板等产生。SPARC在多种组织细胞中表达，尤其在发育和重建的组织中呈高表达，然而SPARC是否可做为肿瘤标志物尚少见报道，本文对此进行了研究。
1材料与方法
1.1临床资料50例喉鳞癌组织标本取自中国医学科学院肿瘤和安徽医科大学第一附属医院喉鳞癌住院患者手术切除的组织标本， 同时取距癌组织4cm处正常组织作为对照。 患者术前皆未行放疗、 化疗或其他针对肿瘤的, 术后病理证实其切缘为阴性。 每一例标本离体后,即置液氮中, 放入-80℃贮存。
1.2主要试剂和仪器Trizol(GIBCO公司), Taq DNA聚合酶(GIBCO公司), RNase inhibitor RNA酶抑制剂(PROMEGA公司), dNTPs(TAKARA公司), pUC Mix Marker 8(MBI Fermentas公司)。DAB（3,3?二氨基联苯胺）显色剂、0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）、防脱片剂APES、0.01mol/L PBS磷酸盐缓冲液、封闭用正常兔血清、SP?9002和SP?9003试剂盒均购自北京中山金桥生物技术有限公司。山羊抗人SPARC多克隆抗体购自Santa Cluz公司。9600 PCR扩增仪(美国PERKIN ELMER公司), 凝胶成像扫描仪(美国Bio?Rad公司)。
1.3引物管家基因β?actin RT?PCR引物, 片段长度212bp，上游引物序列为5'?GGCTACAGCTTCACCACCAC?3';下游引物序列为5'?AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG?3'。目的基因 SPARC引物, 片段长度406bp。上游引物序列为5'?TTGCCTGAGGCTGTAACTGA?3'；下游引物序列为5'?GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG?3'。由上海博亚公司合成。
1.4RT?PCR扩增目的基因SPARC时, 其内参照用管家基因β?actin。 PCR 反应体系: 10×Buffer 2.5μl, 25μmol/L dNTP 2.5μl, 25μmol/L MgC12 1.5μl, 10μmol/L SPARC上游引物1μl, 10μmol/L下游引物1μl, Taq酶0.2μl, cDNA 1μl, 蒸馏水15.3μl。 其PCR反应条件： 94℃预变性5min 94℃ 30s； 58℃ 30s； 72℃ 40s。 27 个循环， 72℃延伸10min。
1.5图像和数据分析RT?PCR 产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳条带图像用凝胶成像扫描仪扫描成 TIFF格式的文件,用Multi?Analyst 软件定量分析电泳分离的各特异扩增条带的原始光密度值，电泳条带的光密度值代表基因的表达水平。所有配对组织的数据均用β?actin的扩增条带光密度值标准化后，再进一步用SPSS11.5软件分析。
1.6免疫组织化学染色法常规进行组织石蜡切片，按照试剂盒说明书进行操作。以PBS代替SPARC抗体作为阴性对照。SPARC阳性表达为细胞核和细胞浆呈棕黄色染色。参照的判定标准，根据阳性细胞数不同可以分为5个等级：<1%为0分；1%~24%为1分；25%~49%为2分；50%~74%为3分；75%~100%为4分。依据染色强度进行半定量判定，分数标准：无色为0分；淡黄色，即弱阳性为1分；棕黄色，即中等染色强度为2分；棕褐色，即强阳性为3分。免疫反应的得分为阳性细胞的百分率得分与免疫染色的强度得分的乘积。
1.7统计学分析应用SPSS11.5软件对各种差异蛋白表达量与临床病理生物学行为的关系的分析采用χ2检验, P<0.05认为差异有统计学意义。
2结果
2.1SPARC基因的RT?PCR检测结果RT?PCR分析SPARC在20对喉鳞癌组织和其相邻的正常粘膜组织中的表达, 在其中16对喉鳞癌组织中的表达明显高于其相应的正常粘膜组织, 在4对中差异表达不明显, R=80.0%(有差异的例数/总例数)。 SPARC在不同分化程度之间表达差异无统计学意义(P=0.877)， SPARC的表达与淋巴结转移与否差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2SPARC蛋白的免疫组化检测结果30例喉鳞癌组织中有25例SPARC表达阳性，SPARC定位于癌细胞的核和细胞浆。然而，正常喉鳞癌组织中SPARC均表达阴性，两者之间差异有统计学意义（P<0.01）。SPARC的表达水平与食管癌的分化程度无关。高分化与中低分化癌组织之间差异无统计学意义（P>0.05）。SPARC的表达与食管癌临床特征的关系：SPARC的表达阳性例数与患者的年龄、性别及组织分化程度无关（P>0.05）；与淋巴结转移与否有关（P<0.05）。
3讨论
从mRNA和蛋白两个水平分析得出SPARC在喉鳞癌中表达上调, 提示 SPARC基因与喉鳞癌的发生关系密切,很可能是重要的喉鳞癌相关基因。SPARC的表达是受转录因子AP?2间接调控的，AP?2结合位点作为增强子组件的一部分，可以介导上皮细胞类型特异性基因的表达。因此推测， AP?2可能参与鳞状上皮细胞分化相关基因的异常表达[2]。有多种恶性肿瘤被确认为有SPARC上调表达，如结直肠癌组织等[3]。也有些肿瘤组织呈低水平表达或不表达如卵巢癌和非小细胞肺癌等[4、5]。结果显示SPARC可在细胞浆表达也可在细胞核中表达。这与报道只在细胞浆表达不一致[6]。Gooden MD等[7]报道，SPARC在鸡胚胎细胞核中被检测到，在这些细胞处于分裂中期和后期呈细胞浆表达。Gooden MD又发现，提取小牛大动脉上皮细胞的可溶性蛋白和DNA后，也在这些细胞的核基质中检测到SPARC。SPARC在非小细胞肺癌（NSCLC）支气管软骨细胞的核和浆均呈高表达[5]。部分肿瘤组织中细胞核内的免疫反应明显增强，即存在蛋白向胞核转位现象。推测这种细胞内的转位现象与另一种钙离子结合蛋白?Annexin I 相似，后者参与食管上皮细胞的分化，它们的低表达及异常定位与食管癌的发生发展有关[8]。这些发现打破了仅认为SPARC是调节细胞与细胞外基质之间相互作用的分泌性糖蛋白的观点，为SPARC可能在核基质中也发挥相似的功能提供了新线索。SPARC是头颈部肿瘤患者预后的有价值指标[9、10]。然而SPARC参与生理、病理活动的具体过程和机制仍不十分清楚，需要进一步的研究。
【文献】
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