平阳霉素乳剂对增生期毛细血管瘤细胞微环境的影响

                作者：徐伟立 牛爱国 李索林 时保军

【摘要】  目的探讨平阳霉素(pingyang mycin, PYM)乳剂对增生期毛细血管瘤细胞微环境的影响，为血管瘤提供新思路。方法选取婴儿体表增生期毛细血管瘤30例，随机分为两组，将PYM制成乳剂，涂于用药组瘤体表面，1次/8小时；对照组则只涂以基质。用药7天后，手术切除瘤体，检测两组瘤体组织中VEGF、细胞外基质及细胞凋亡指数，分别进行统计学处理。另各取两组2例电镜观察细胞超微结构变化。结果两组间VEGF表达（P<0.05）和细胞外基质表达均有显著性差异(P<0.01)；细胞凋亡指数比较有非常显著性差异（P<0.01）。结论外用PYM乳剂可通过降低增生期毛细血管瘤组织中VEGF表达、抑制细胞外基质合成与再生和诱导细胞凋亡而促进其消退。

【关键词】  平阳霉素；血管瘤；VEGF；细胞外基质；细胞凋亡

　　Pingyangmycin Emulsion Influencing on  Microenvironment of  Infantile Proliferating  Capillary Hemangiomas

　　　　Abstract：Objective To explore pingyang mycin(PYM) emulsion influencing on the microenvironment of infantile proliferating capillary hemangiomas so as to find the optimal method for hemangiomas' treatment.  MethodsThirty samples of infantile proliferating hemangiomas were divided into control group and experimental group. PYM was made into emulsion and smeared on the surfaces of the leision in experimental group with 3 times every day as well as only matrix in control group. The specimens were cut  off  on day 7,then made into pathological slices and electron microscope slices in order to observe the cells ultrastructure changes. Furthermore, VEGF, extracellular matrix(P<0.01)  and apoptotic index in hemangiomas were detected respectively.  ResultsVEGF (P<0.05), extracellular matrix(P<0.01)  and apoptotic index (P<0.01) of two groups had all significant difference. ConclusionPYM emulsion can effectively accelerate regression of proliferating capillary hemangiomas whose mechanism is related to the reduction of VEGF expression and prevention of synthesis and regeneration of extracellular matrix and induction of cell apoptosis.

　　Key words：Pingyangmycin; Hemangioma; VEGF; Extracellular matrix; Apoptosis

　　0引言

　　毛细血管瘤是婴幼儿时期最常见的一种良性软组织肿瘤，发病率高，生长迅速，易致颜面等毁容，治疗十分必要。 平阳霉素（pingyangmycin，PYM）瘤体内注射是临床较常用的一种治疗血管瘤的方法，但其用药剂量和注射深度难以掌握，易致皮肤局部纤维化和坏死等并发症[1]。因此我们将其制成乳剂涂于瘤体表面，使其温和而持久的发挥作用。本文旨在研究PYM乳剂对增生期毛细血管瘤细胞微环境的影响，探讨其促使瘤体消退的机制，为临床血管瘤的治疗提供新思路。

　　1资料与方法

　　1.1资料选取6月以内婴儿体表毛细血管瘤志愿患儿30例，随机分为两组，对照组10例，男3例、女7例，平均年龄（3.37±1.76）个月（2天~6个月）； 用药组20例，男9例、女11例，平均年龄（3.70±1.33）个月（2~6个月）。两组瘤体分布情况为：腮腺区1例，颈部3例，四肢7例，余19例均位于躯干部。术后据病理组织学表现，参照Mulliken标准[2]均证实为增生期毛细血管瘤。

　　1.2方法

　　1.2.1光镜标本制取及观察将PYM（天津太和制药厂生产）加入一定量助渗基质利用超声雾化技术制成2mg/dl的乳剂（O/W型），征得家属同意后，涂于用药组瘤体表面，1次/8小时；对照组则只涂以基质。用药7天后两组一起手术切除瘤体，以0.9%的等渗生理盐水仔细冲净瘤体血液，取其距表皮约5mm左右组织块以10%甲醛固定、包埋、切片、染色，置光镜下观察。

　　1.2.2电镜标本制取及观察随机选取两组中受试对象各2例，以同样方式用药7天后，取其中央处生长旺盛瘤体组织，切除约1mm3组织块迅速放入4%戊二醛溶液中固定，制备电镜标本以透射电镜观察。

　　1.2.3瘤体VEGF测定（免疫组化法）血管内皮细胞膜和（或）胞浆染成棕黄色为阳性细胞。在400倍显微镜下随机观察5个视野，计数500个内皮细胞中阳性细胞个数，按阳性细胞所占比例进行分级：0~25%（-）；26%~50%（+）；51%~75%（++）；76%~100%（+++）。

　　1.2.4瘤体IV型胶原（Col?IV）、层粘连蛋白（LM）、纤维粘连蛋白（FN）测定（免疫组化法）各项指标显微镜下观察分3个等级：①强阳性（+++），于毛细血管基底膜呈清晰的深棕褐色连续线状表达，线条粗大、染色深；②弱阳性（++），于毛细血管基底膜呈棕色的间断线状表达，线条纤细、染色浅；③微弱阳性（+），于毛细血管基底膜呈浅棕色碎片状表达，几乎见不到连续染色，且染色很淡。

　　1.2.5凋亡指数测定采用TUNEL方法，参照博士德公司细胞凋亡检测试剂盒提供的说明书进行试验。以细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。每例切片高倍显微镜下观察10个视野，每个视野计数100个细胞，统计其中凋亡阳性细胞数。凋亡指数=染色阳性细胞数（10个HPF中）/计数细胞总数（100×10）×100%

　　1.3统计分析  两组VEGF及Col?IV、LM、FN表达的比较采用秩和检验，两组凋亡指数的比较采用t检验。

　　2结果

　　用药组14例用药7天后出现瘤体颜色变暗，表面轻度皱缩，6例无明显变化。无1例出血、坏死及溃烂现象，无发热、消化道反应等并发症出现；对照组则无任何变化。两组VEGF及3种细胞外基质成分的表达均明显降低，见表1、2，图1~8。两组标本TUNEL染色后，用药组可见大量棕黄色阳性细胞，比对照组明显增多，见图9~10。用药组凋亡指数32.005±19.048，对照组凋亡指数9.600±5.397，两者比较差异有统计学意义（t=3.618，P<0.01）。光镜下对照组血管瘤内皮细胞增生旺盛，可形成内皮细胞团；用药组可见瘤内血管间纤维组织增生。电镜下对照组标本内皮细胞排列紧密，细胞外形及细胞器外形分布正常，核异染色质分布均匀，少见凋亡现象。用药组多见内皮细胞皱缩，体积变小，细胞器互相靠近浓缩，核异染色质边集于核膜下，形成新月体结构，见图11；内皮细胞核固缩，即将形成凋亡小体，见图12。

　　表1两组VEGF比较（略）

　　表2两组细胞外基质比较（略）
　　
　　3讨论

　　毛细血管瘤是一种胚胎性血管发育异常，其确切发病机制不完全清楚。研究表明[3]，血管形成的环节包括：内皮细胞的增生、移行；细胞外基质的产生；血管状结构的形成和再通。在这个过程中，内皮细胞、血管形成因子、细胞外基质等均起到重要作用，它们构成了血管瘤的微环境基础。因此寻找影响血管瘤微环境，促使其消退的方法可为血管瘤的提供新思路。PYM是一种由链霉菌产生的抗肿瘤抗生素，PYM瘤体内注射是临床常用的治疗血管瘤的方法，疗效较为肯定[1]，但此法难以使注射后药物在瘤体组织中均匀分布，且注射剂量和深度难以掌握，注射时产生剧痛，易致组织坏死，瘢痕挛缩等并发症，家属和患儿难以接受。因此，我们将PYM制成乳剂，均匀涂抹于瘤体表面，使药物持续而温和发挥作用，使用较安全、方便。本研究中，用药后2/3瘤体颜色由鲜红转为发暗，表皮轻度皱缩，而对照组无任何改变，说明药物确实能有效渗入瘤体发挥作用。血管内皮细胞生长因子是一类能诱导和促进毛细血管形成的物质。Zhang等[4]研究发现VEGF是目前所知道的最强烈的直接作用于血管的因子，其表达与血管瘤的发病、分期及疗效评价密切相关，且增生期血管瘤VEGF表达明显高于消退期。本研究中，增生期毛细血管瘤使用PYM乳剂后VEGF的表达水平比对照组明显降低（P<0.05），说明PYM可通过降低VEGF蛋白的表达来抑制内皮细胞增生，促使血管瘤消退。细胞外基质是指位于内皮细胞下层结缔组织周围，为组织、器官甚至整个机体的完整性提供力学支持和物理强度的物质，是血管形成的必要条件之一，其中与血管瘤关系最密切的细胞外基质主要为Col?IV、LM和FN[5]。本研究中，对照组Col?IV、LM、FN着色深，均呈棕褐色粗线条状连续强阳性表达，而经PYM乳剂治疗后镜下观察则染色浅，呈间断的细线状或散在点状弱阳性表达，与退化期的血管瘤组织镜下表现完全一致。这说明PYM乳剂能很好地渗入瘤体组织，使细胞外基质表达呈现退化期的表现，瘤体中毛细血管壁失去相应的力学支持，血管萎缩，瘤体逐渐消退。研究发现细胞凋亡是血管瘤消退的重要原因，而其相关基因bcl?2、bax等扮演了重要角色[6]。在本研究中，PYM乳剂治疗后，电镜下多见细胞凋亡现象，进一步的TUNEL实验从分子水平证实了治疗后的瘤体组织细胞凋亡率明显升高，有非常显著意义（P<0.01），说明PYM乳剂确实可促进增生期毛细血管瘤细胞发生凋亡。实验中还发现，越趋近于管腔结构周围的细胞，其凋亡率明显升高。推断可能是PYM通过血液循环作用于血管瘤体，使位于管腔周围的细胞受到药物的影响较大，故发生凋亡机会增加或可认为是对血管内皮细胞有特异性促凋亡作用的结果。可以看出，外用PYM乳剂可通过降低增生期毛细血管瘤组织中VEGF表达、抑制细胞外基质的合成与再生和诱导细胞发生凋亡而促进其消退。这三种因素在体内又互相影响，互相联系。比如VEGF以自分泌方式调节细胞周期，使细胞凋亡减少；又可以改变细胞外基质，使其易于血管的生长；而细胞外基质可以促进内皮细胞的粘附、生长和分化。因此，外用PYM乳剂后降低了VEGF表达，使凋亡优势大于增殖，细胞外基质合成减少，这些均利于血管瘤消退。目前，国内有人外用PYM治疗尖锐湿疣，疗效肯定，但外用PYM作为一种新的治疗血管瘤的方法尚未见报道，其药物吸收浓度、用药疗程及远期疗效尚待进一步深入研究。

【】
  　　［1］刘学键，秦中平，李克雷.平阳霉素治疗口腔颌面部血管瘤的远期疗效及适应证探讨[J]. 上海口腔医学，2001，10（4）：295?298.

　　［2］John B,Mulliken MD,Glowacki PHD. Hemangiomas and vascular malformation in infants and children:A classification based on endothelial characteristics[J]. Plast Reconstr Surg,1982,69(3):412?422.

　　［3］Tonnesen MG, Feng X, Clark RA. Angiogenesis in wound healing[J]. J Invest Dermatol Symp Proc， 2000, 5(1):40?46.

　　［4］Zhang L, Lin X, Wang W,et al. Circulating level of vascular endothelial growth factor in differentiating hemangioma from vascular malformation patients[J]. Plast Reconstr Surg,2005,116(1):200?204.

　　［5］Tan ST,Velickovic M,Ruger BM,et al. Cellular and extracellular markers of hemangioma[J]. Plast Reconstr Surg, 2000,106(3):529?538.

　　［6］王彪，庄福连，张鹏飞，等.细胞凋亡及Bcl?2、Bax在血管瘤和血管畸形中的表达[J]. 中华整形外科杂志，2003，19（5）：347?349.