电针对大鼠脑缺血再灌注模型P

           作者：刘玉珍，韩景献，蒋戈利，丁晓荣，陆明霞

【关键词】  针刺；,,脑缺血/再灌注；,,P

　　摘要：目的探讨针刺抗脑缺血再灌注炎性损伤的机理。方法采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型（MCAO），采用免疫组织化学技术测定P-选择素和E-选择素表达的动态变化。结果在灌注3 h各实验组P选择素和E选择素均开始表达，二者均于再灌注24 h均达到高峰（组内比较P＜0.01），持续至再灌注48 h，针刺可显著降低P-选择素和E-选择素的表达（与模型组和非穴组比较，P＜0.01 ）。结论P选择素和E选择素的表达上调与再灌注后的炎症反应有关，早期针刺可能通过下调脑缺血区黏附分子P选择素和E选择素的表达而防治脑缺血再灌注炎性损伤。

　　关键词：针刺；  脑缺血/再灌注；  P选择素；  E选择素

　　Effect of Galvano-acupuncture on the Expression of P-selectin and E-selectin of Cerebral Ischenic Region in Rats

　　Abstract：ObjectiveTo study mechanisms of early treatment of cerebral ischemia-reperfusion(I/R) by galvano-acupuncture in resisting inflammation injury in rats.MethodsCerebral I/R model was established by occlusion of the middle cerebral artery for 1h and then removal of the occlusion for 3 h ,12 h,24 h, and 48 h respectively .The expression of P-selectin and Eselectin was displayed by using imunohistochemical ABC in ischemic cerebral cortex and corpus striatum in rats.ResultsThe expression of P-selectin and Eselectin was detected at capillary walls in postischemic cerbral cortex at 1 h ischemia-3 h reperfusion and peaked at 1h ischemia-24 h reperfusion and increased continuously during 48 h reperfusion.The expression of both Pselectin and Eselectin in ischemic cerebral cortex were downregulated considerably by galvano-acupuncture treatment (P＜0.01) .ConclusionThe protective effect of acupuncture on cerebral neurons under acute infarction is possible through its downregulative action on the expression of Pselectin and Eselectin,which causes neutrophil infiltration that induced by adhesive molecules between endothelium cell  and neutrophil.

　　Key words：Acuppuncture;  Cerebral ischemic/reperfusion ;  Pselectin;  Eselectin
   
　　近年研究表明，脑缺血及脑缺血再灌注的病理过程中，周围血中性粒细胞向缺血区的迁移、浸润引发炎症反应加重了脑损伤，P选择素（Pselectin）和E-选择素（Eselectin）在白细胞与内皮细胞作用的起始阶段发挥重要作用。本课题拟建立大鼠局灶性脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤模型，实施针刺干预，观察针刺对脑血区P选择素和E选择素表达的影响，旨在证明早期针刺治疗对脑缺血损伤的有效防治途径是通过对脑缺血后炎症反应的免疫调节机制实现的。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物分组健康雄性Wistar大鼠130只，体重（260±20）g，由医学院实验动物研究所提供。按随机分组原则分成以下几组：假手术组与实验组，实验组分为脑缺血1 h/再灌注3，12，24，48 h模型对照组（模型组）、非穴位针刺组（非穴组）和电针治疗组（电针组）。每组各10只。

　　1.2  脑缺血再灌注大鼠模型的建立及组织制备参照Longa［1］的改良的方法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。10%水合氯醛（330 mg/kg）腹腔麻醉，消毒颈部皮肤，沿颈正中线做一长度约2 cm的切口，仔细分离暴露出右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。在右侧颈总动脉接近分叉处以眼科剪剪一“V”形小口，将头端用火焰烧成光滑球面（直径为2.5～2.8 mm）的4-0单股尼龙线从小口缓慢插入，经颈总动脉分叉处进入右侧颈内动脉入颅，插线深度1.8～2.0 cm，栓塞右大脑中动脉。消毒并缝合切口，手术过程中大鼠肛温维持在（37±0.5）℃。栓塞1 h后，缓慢拨出尼龙线进行再灌注，根据所需的再灌注时间段取脑。假手术组不插线，其他同手术组。

　　1.3  神经病学评分按Longa［1］5分法进行神经病学评分：0分，无神经缺损症状；1分，不能伸展对侧前爪；2分，行走时向偏瘫侧转圈；3分，向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。其中，0分及4分者被剔除。

　　1.4  电针治疗方法根据华兴邦等［2］研制的“大鼠穴位图谱”，选取水沟、内关、三阴交穴。

　　1.4.1  操作方法取人中，向鼻中隔方向斜刺，将针体旋转360°行雀啄手法，直刺双侧内关、三阴交，行提插捻转泻法1 min。非穴位针刺组：选取双侧胁下2个固定非穴点，用平补平泻捻转手法1 min。通以G6805Ⅱ型电针治疗仪，频率为4~16 Hz，波形为断续疏密波，刺激强度为2V。持续时间为10 min。

　　1.4.2  治疗时机I/R后3 h，12 h针刺组于脑缺血即刻、再灌注即刻相应时间点分别进行电针治疗：I/R24 h，48 h针刺组除此之外每12 h治疗1次。

　　1.5  取材10%水合氯醛足量腹腔麻醉大鼠，4%多聚甲醛（4℃，pH 7.4）用BT100恒流泵心脏灌流固定取脑，发现颅底淤血者剔除。从视交叉至脑桥前缘冠状位切取脑组织2块，每块厚约3 mm，置于同一固定液中4℃，1～2 h，进行OCT包埋，冰冻切片机连续切片，厚度为20 μm，分别每隔6张取一张贴片，贴附于载玻片，用于免疫组化，干燥，保存于20℃备用。

　　1.6  免疫组化染色（ABC法）小鼠单克隆抗Pselectin抗体（1∶100）、免多克隆机ESelectin抗体（1∶100）购自Santa Cruz公司，SP法免疫组化染色，DAB显色。

　　1.7  阳性评定及分析在光镜下毛细血管着色呈棕黄色为P-选择素和E-选择素表达阳性。在400×镜下，每组各选取5张切片，每张切片在缺血区随机选取5个不重叠视野，用MPIAS-1000多媒体彩色病理图文分析系统（同济医科大学清平影像公司研制）进行图像分析，测量血管计数（即一个视域中阳性信号的总血管个数）、积分光度（即各个单独探测的像素密度分布的总和，反应阳性信号的强度），分析P选择素和E选择素的表达情况。结果用±s表示。统计学处理采用SPSS10.0软件进行方差分析和t检验。

　　2  结果

　　2.1  P选择素的表达阳性染色为棕黄色的微血管和毛细血管，小血管和大血管呈阴性反应。假手术组P选择素无表达。在实验组，I/R3 h 脑缺血区的阳性血管开始出现阳性表达，I/R24 h达到高峰，持续至I/R48 h。阳性信号显示明显的区域性，即缺血灶中心区及半暗带区。电针组P选择素表达显著减少，与模型组和非穴组相应时间点比较，具有极显著性差异（P＜0.01）。结果见表1及图1~3。

　　2.2  E选择素的表达阳性染色与P选择素表达相似，假手术组E-选择素未见表达；在实验组，阳性血管表达在脑的不同区域也显示出明显的区域特征，与上述P选择素表达在脑的分布基本一致。I/R3 h脑缺血区的阳性血管开始阳性表达，I/R24 h达到高峰，48 h仍有阳性表达。电针组E选择素的表达明显减少，与模型组和非穴组相应时间点比较，具有显著性差异（P＜0.01）。结果见表1及图4~6。

　　表1  再灌注后脑缺血区P选择素和E选择素的阳性血管数目和积分光度（略）

　　与其他各组比较，*P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.05；与模型组和非穴组比较，△P＜0.05,△△P＜0.01

　　图1I/R24 h模型组缺血区P选择素     表达（免疫组化DAB显色×400） （略）

　　图2I/R24h非穴组缺血区P选择素     表达（免疫组化DAB显色×400）（略）

　　图3I/R24h电针组缺血区P选择素     的表达（免疫组化DAB显色×400）（略） 

　　图4I/R24h模型组缺血区E选择素     表达（免疫组化DAB显色×400）（略）

　　图5I/R24h非穴组缺血区E选择素     表达（免疫组化DAB显色×400）（略）

　　图6I/R24h电针组缺血区E选择素     表达（免疫组化DAB显色×400）（略）

　　3  讨论

　　炎症反应在脑缺血的病理损伤过程中起重要作用。研究表明，再灌注后白细胞与微血管内皮细胞的黏附性增加，白细胞的贴壁滚动、初次黏附、紧密黏附及穿越内细胞及基膜，1～2 d内主要以多形核白细胞（polymorphonuclear leukocytes,PMNs）为主［3］，与表达在内皮细胞上的黏附分子有密切关系［4］。P-选择素和E-选择素是选择素家族的重要成员，P选择素通常储存于内皮细胞的分泌颗粒（Weibel Palade小体）和静止的血小板a颗粒和致密颗粒中，缺血早期在氧自由基、NO及细胞因子肿瘤坏死因子a(TNFa)［5］，白介素1 β(IL1β)等的诱导下，Weibel Palade小体和血小板a颗粒迅速与质膜融合而使P-选择素在内皮细胞和血小板表面表达［6］。P-选择素在细胞表面的表达是内皮细胞和血小板活化的标志，它参与介导血小板的活化及内皮细胞与中性粒细胞和单核细胞的黏附，在炎症、血栓形成中起重要作用。E-选择素是一种血管内皮合成的可诱导性单链糖蛋白，主要在活化的内皮细胞上表达，体外研究发现TNFa，IL1β，淋巴毒素和脂多糖可诱导E-选择素的表达。正常内皮细胞无E-选择素表达，且胞内也无储存，它是介质白细胞与内皮细胞起始黏附作用的重要分子。血管内皮细胞表面上调的P选择素，与活化白细胞表面细胞间黏附分子1（ICAM1）和E选择素，以及白细胞表面L选择素的活化实现了PMNs与血管内皮的紧密黏附，最终导致PMNs的移行浸润。炎症反应是级联反应导致细胞损伤的重要病理环节，能导致继发性神经元损伤。本病属中医学“中风病”范畴，中风病的病机关键是“窍闭神匿，神不导气”，人中刺之可直达脑府，激发神气再现；内关治心以调脉治血；三阴交补肾滋阴生髓。三穴共奏醒脑开窍、调神复神之功。本实验结果证实了再灌注后血管内皮激活，使黏附分子P选择素和E选择素蛋白合成增加，介导了再灌注后白细胞与血管内皮的接触、黏附与游出血管，形成了白细胞浸润为核心表现的炎症反应，加重了组织水肿和继发性损伤。早期针刺后P选择素和E选择素表达明显下调，推测针刺治疗于起始阶段抑制了白细胞与血管内皮的黏附，阻断了白细胞的跨内皮迁移，在炎症细胞浸润的关键环节起到抑制作用，继而阻断再灌注后的炎症级联反应发挥其神经元保护作用。

　　：

　　［1］  Zea Longa EL.Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversibe middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke,1989,20(1):84.

　　［2］  华兴邦，李辞蓉，周浩良，等.大鼠穴位图谱的研制［J］.实验动物与动物实验，1991，（1）：1.

　　［3］  Yamagami S,Tamura M,Hayshi M,et al.Differential production of MCP1 and cytokine-induced neurophil chemoattractant in the ischemic brain after transient focal ischmia in rats.J Leukoc Biol.1999,65:744.

　　［4］  Blann A,kumar P,Krupinski J,et al.Soluble intercellular adhesion molecule-1,E-selection,vascular cell adhesion molecule-1 and von willebrand  factor in stroke［J］.Blood Coagul Fibrinolysis ,1999,10:277.

　　［5］  Yao L,Setiadi H,Xia IJ ,et al.Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates［J］.Blood,1999，94（11）：3820.

　　［6］  Thomas WS,Mori E,Copeland BR,et al.Tissue factor contributes to microvascular defects after focal cerebral ischemia［J］.Stroke 1993,24:847.