地锦草总黄酮预防四氯化碳所致急性肝损伤的实验研究

          作者：曹瑞珍， 魏永春， 强欣， 乔伟

【关键词】  地锦草；,,总黄酮；,,急性肝损伤；,,四氯化碳

　　摘要：目的研究地锦草总黄酮(total flavonoids of Euphorbiae humifusae，TFEH) 对四氯化碳造成的小鼠急性肝损伤的保护作用。方法四氯化碳造成小鼠急性肝损伤模型,测定血清谷丙转氨酶(serum glutamic pyruvic transaminase,SGPT)、肝组织谷丙转氨酶(liver glutamic pyruvic transaminase,GPT)、超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)活性及丙二醛(malonaldehyde,MDA)、还原性谷胱甘肽（GSH）含量,采用光镜观察肝脏组织学变化。结果与四氯化碳模型组比较,经TFEH预防性后,GPT、LGPT活性和MDA含量均明显降低(P<0.05或P<0.01),而GSH含量和SOD活力明显增高(P<0.05)。通过病切片观察,TFEH明显改善肝组织的病理变化。结论TFEH对四氯化碳造成的小鼠急性肝损伤具有保护作用。

　　关键词：地锦草；  总黄酮；  急性肝损伤；  四氯化碳

　　Protective Effect of Total Flavonoids of Herba Euphorbiae humifusae against Hepatic Injury Induced by CCl4 in Mice

　　Abstract：ObjectiveThe protective effect of total flavonoids Euphorbiae humifusae against CCl4-induced hepatic injury in mice was observed. MethodsAcute liver injury model in mice was made by using CCl4. The levels of SGPT, LGPT in serum and MDA, SOD,GSH in liver and hepatic pathological tissue were observed.  ResultsCompared with model control group, the levels of serum SGPT, LGPT, liver MDA of the mice treated with TFEH significantly decreased(P<0.05 or P<0.01),while the activity of SOD and the level of GSH increased greatly(P<0.05). By observation of pathological slices, TFEH could improve hepatic pathological changes distinctly.  ConclusionTFEH can prevent CCl4-induced hepatic injury.

　　Key words：Herba Euphorbiae humifusae;  Total flavonoids;  Acute liver injury;  Carbon tetrachloride
   
　　地锦草为常用的中蒙药材，具有清热解毒、燥湿、活血等功效［1，2］，通过药理学研究证实地锦草主要含有槲皮素及其苷、山奈素及其苷等黄酮类化合物［3］。报道地锦草治疗病毒性肝炎取得疗效［4］；本课题组前期研究了TFEH药理学活性［5，6］，发现其水及乙醇提取物具有良好的抗脂质过氧化等作用。在此基础上,我们研究了TFEH对四氯化碳造成的小鼠急性肝损伤的保护作用,并探讨其可能作用机制及其应用前景。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  动物纯系昆明种小鼠50只，体重 (25±2) g，雌雄各半,由锦州医学院实验动物中心提供。饲养环境:温度22～25℃,湿度70%。

　　1.1.2  药品与试剂地锦草购于内蒙古民族大学附属蒙药制剂室，由蒙药系布和巴特教授鉴定。测定试剂盒均来自南京建成生物工程研究所。

　　1.1.3  仪器7230分光光度计(上海第三分析仪器厂),光学分析天平、FA160天平（上海天平仪器厂),IGL-16台式高速离心机（上海安亭仪器厂),旋转蒸发器(上海青浦沪西仪器厂)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  药物配制取地锦草粗粉（20目）150 g加75%乙醇900 ml，浸泡12 h，回流提取1.5 h，提取3次，合并提取液，回收乙醇，加蒸馏水溶解并定容至400 ml，配成1 ml含生药0.375 g，黄酮含量为16.7 mg/ml(经蒙医药学院蒙药分析化学教研室检测)，再2∶1稀释成0.25 g生药/ml，以此作为高剂量组的给药浓度。再配制低剂量组的给药浓度0.125 g生药/ml。

　　1.2.2  动物分组及给药方法小鼠40只,按随机数字表法分为4组,每组10只:①组为正常对照组, 每次1ml蒸馏水灌胃;②组为模型对照组,灌胃等容积常用水;③、④组分别为TFEH高、低剂量治疗组, 1次/d，1 ml/次，浓度分别为0.25 g生药/ml，0.125 g生药/ml；上述各组均给药1次/d,连续1周。末次给药后,②～④组小鼠按10 ml/kg腹腔注射0.15%四氯化碳豆油溶液1次,建立急性肝损伤模型。注射四氯化碳后禁食20 h,断头取血,离心得血清,并快速取肝脏,取肝左叶组织约0.5 g,在冰冷的生理盐水中漂洗,滤纸拭干,以生理盐水用组织匀浆器制成10%肝组织匀浆,离心,取上清液,准备检测各指标。

　　1.2.3  生化指标检测血液及肝检测指标:SGPT，LGPT，MDA，SOD和GSH,按试剂盒要求进行测定。

　　1.2.4  病理学检查取部分肝右叶组织做病理学检查,将其放于10%甲醛溶液中,石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察。

　　1.3  统计学处理所有实验数据以 ±s表示,采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  急性肝损伤小鼠生化指标检测由表1可以看出, 与模型组比较TFEH能显著降低血清和肝脏GPT活力(P<0.01);由表2可以看出,与模型组相比较,TFEH能明显降低MDA的含量(P<0.05),还能明显提高SOD活性(P<0.05),高低剂量之间没有显著性差异;同时,TFEH能增加肝脏GSH的含量,与模型组比较,高剂量组有明显差异(P<0.05)。

　　表1  TFEH对急性肝损伤小鼠SGPT,LGPT的影响（略）

　　与正常对照组比较,★★P<0.01;与模型对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；n=10

　　表2  TFEH对急性肝损伤小鼠MDA、SOD和GSH的影响（略）

　　与正常对照组比较，★ P<0.05,★★P<0.01;与模型对照组比较，#P<0.05；n=10

　　2.2  急性肝损伤小鼠肝脏病改变正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色,质地软而富有弹性; 镜下见肝小叶结构清晰,细胞排列整齐,大小均匀,分界清楚,细胞核位于细胞中央,圆而清晰（见图1）；模型对照组小鼠肝脏体积增大,质脆,边缘钝而厚,表面呈黄褐色; 镜下可见肝细胞水肿及小叶中心区肝细胞坏死,坏死的肝细胞发生核固缩、碎裂及溶解，致肝细胞索分离（见图2）；TFEH高、低剂量组肝脏略有水肿,质地柔软; 镜下见肝小叶结构基本完整,细胞排列较整齐,肝细胞轻度水肿，小叶中央区散在少许点状坏死灶，淋巴细胞浸润，变性、坏死较模型组显著改善,且高剂量组比低剂量组的更轻一些（见图3~4）。

　　图1  正常对照组肝组织     HE染色×100 （略）              

　　图2  模型对照组肝组织     HE染色×100  （略） 

　　图3  低TFEH组肝组织     HE染色×100 （略）            

　　图4  高TFEH组肝组织     HE染色×100 （略）  

　　3  讨论

　　肝病是一种发病率高、难以根治的疾病,对人类健康危害极大,而且不良的饮食习惯、药物、毒物等均能导致肝脏疾病,损害肝细胞。大量研究表明,在肝细胞病变过程中,自由基、酶以及脂质过氧化等均发挥重要作用。四氯化碳致小鼠肝损伤模型,一直被广大学者所应用,其机制为:四氯化碳在肝内经微粒体细胞色素P450分解活化,形成三氯甲基自由基(CCl3・)和氯自由基(Cl・),导致肝微粒体的脂质过氧化［7］。由于脂质过氧化反应增强而抗氧化能力下降,导致自由基生成增加,通过过氧化细胞膜脂质,使肝细胞结构和功能受到损害［8］。［9］报道化合物中的酚羟基是抗脂质过氧化作用的功能基团,地锦草所含黄酮类化合物槲皮素及其苷、山奈素及其苷等,含有酚羟基结构基团,因而发现黄酮类化合物具有保肝护肝作用。实验显示,TFEH能显著降低血清和肝脏GPT活力(P<0.01),从而减少丙酮酸生成,使还原型NADPH含量增高,以此增强肝细胞抗氧化、清除自由基、抑制脂质过氧化的能力。TFEH还明显降低MDA含量(P<0.05),增加GSH含量,是由于所含酚羟基的抗脂质过氧化作用,直接捕捉、清除自由基,生成自由基中间体,阻断或终止自由基连锁反应链,从而阻止或抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应,最终抑制脂质过氧化终产物MDA的生成,减轻肝脏还原型GSH的耗竭［10］，但GSH含量增加不明显,与模型组比较,无统计学意义。TFEH同时明显提高肝脏SOD活力(P<0.05),这与黄酮类化合物参与调节和提高体内抗氧化酶的活性有关［11］。病理学检查表明,TFEH能明显预防急性肝损伤,减轻肝细胞形态结构的损伤,提示TFEH具有保护损伤肝细胞的作用。

　　文献：

　　［1］  医学百科全书编辑委员会.中国医学百科全书蒙医学［M］.上海：上海科技出版社，1992：227.

　　［2］  马清钧.常用中药研究与临床 ［M］.天津：天津科技翻译出版社，1995：166.

　　［3］  柳润辉.地锦草化学成分的研究［J］.中草药，2001，32（2）：107.

　　［4］  汪仁柏.地锦草病毒性肝炎65例临床观察［J］.中国医学，1987，（3）：12.

　　［5］   曹瑞珍.大戟科植物地锦草的药效学研究探讨［J］.中医药学刊，2003，21（6）：892.

　　［6］  曹瑞珍，魏永春，佘集凯，等.地锦草提取物对小鼠血液SOD和MDA的影响［J］.内蒙古民族大学学报，2002，17（4）：342.

　　［7］  辛  念，熊建新，韩淑英，等.荞麦种子总黄酮对四氯化碳所致急性肝损伤的保护作用［J］.第三军医大学学报，2005，27（14）：1456.

　　［8］  RouachH,FataccioliV,GentilM,etal.Effect of chronice than olfeeding on lipid peroxid ationand protein oxidation inrelationtoliverpathology［J］.Hepatology,1997,25(2):351.

　　［9］  HusainSR,CillardJ,CillardP.Hydroxy radicalscavenging activity of flavonoids［J］.Phytochemistry,1987,26(9):2489.

　　［10］  王颖芳，王宇亮.中药治疗肝损伤作用机理的实验研究进展［J］.河南中医学院学报,2003,18(1):33.

　　［11］  先  宏，吴  可，孙存普.中药抗氧化活性的主要成分及其自由基清除作用［J］.国外医学中医中药分册,2003,25(3):150.