131I标记抗CD20单克隆抗体在荷瘤裸鼠体内的放射免疫显像

         作者：左强， 张军一， 陈锦章， 罗荣城

【摘要】  目的探讨131I?anti?CD20McAb经瘤内注射后在荷人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞移植瘤裸鼠体内的放射免疫显像。方法131I标记物的标记采用IODO?GEN碘化标记；注射标记物后第1、3、7、15天将荷瘤裸鼠SPECT显像后活杀，定标器测量并瘤、血等12种器官或组织的％ID/g值，根据MIRD委员会推荐的公式计算肿瘤累积吸收剂量。结果131I?anti?CD20McAb瘤内注射组的SPECT显像结果优于腹腔注射组和131I?IgG瘤内注射组，该组肿瘤%ID/g值在给药后第1、3和7天分别为后两组的1.4～17倍和1.7～3.7倍，肿瘤累及吸收剂量在给药后第3、7和15天分别为后两组的1.5～2.5倍和6.0～12.6倍。结论131I?anti?CD20McAb经瘤内途径给药可以使肿瘤获得最高的放射性药物摄取率，为下一步运用该途径进行放射免疫提供了实验依据。

【关键词】  131I；抗CD20单克隆抗体；非霍奇金淋巴瘤；放射免疫显像

    1材料与方法

    1.1材料 抗CD20单克隆抗体由罗氏公司提供，鼠IgG为SIGMA公司产品，Na131I溶液购自成都中核高通同位素公司，人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞由上海细胞研究所提供。

    1.2抗体标记及标记物活性测定抗CD20单克隆抗体和鼠IgG与131I的标记均采用IODO?GEN碘化标记，抗体重量（mg）与131I放射性强度(mci)比为1∶10，纸层析法测定标记物标记率和放化纯度，过量肿瘤细胞抗原结合法测量标记物免疫活性。

    1.3实验动物模型BALB/C裸鼠由南方医科大学动物实验研究所提供，将处于对数生长期的Raji细胞悬液，按6～7×106/ 只，接种于裸鼠右臀部皮下。

    1.4实验分组按肿瘤体积大小将荷瘤裸鼠随机分为4大组，16小组，4只/小组。第1组瘤内注射131I?IgG，第2组瘤内注射131I与抗CD20单抗混合液，第3组瘤内注射131I?anti?CD20 McAb，第4组腹腔注射131I?anti?CD20 McAb。

    1.5体内动态分布研究按预定方案分别注入含有131I标记物，注射后第1、3、7、15天SPECT显像后活杀，摘眼球取血，再取肿瘤、肝、脾、肾、心、肺、胃、大肠、小肠、对侧大腿肌肉及股骨等组织，天平称重，在定标器上测定各组织的放射性活度（cpm），计算各组织的比放射性活度（cpm/g）和％ID/g值（每克组织摄入注入量的百分数）。％ID/g=组织的比放射性活度（cpm/g）/注入标记物的放射性活度（cpm）

    1.6累积吸收剂量计算根据标记抗体在荷瘤裸鼠体内的动态分布％ID/g值，按照MIRD委员会推荐的公式计算肿瘤组织累积吸收剂量[2]。以注射后活杀时间为自变量，％ID/g值为因变量，对4组分别进行曲线拟合，建立曲线方程，运用积分的方法计算曲线下面积，相应值乘以0.5μCi（因注入量的1％为0.5μCi）即得Ah/mk值(μci·h/g)，代入下列公式计算累积剂量（Gy）。Dk＝Ah/mk[∑np△npφnp(rk←→rh)+∑p△pφp(rk←→rh)]式中：Dk：靶器官k吸收剂量（rad）；Ah：源器官累积活度（μCi·h）；mk：靶器官k的质量（g）；∑np△npφnp(rk←→rh)+∑p△pφp(rk←→rh)：给定放射性核素和器官下单位累积放射性活度在单位时间所致的吸收剂量，本实验131I为0.421 g·rad/μCi·h。

    1.7统计学方法使用SPSS 10.0统计软件，采用方差分析。

    2结果

    2.1131I标记物的标记率、放化纯度及免疫活性标记物标记参数见表1。

    2.2荷瘤裸鼠注入不同131I标记物后肿瘤和各组织％ID/g值  131I?anti?CD20McAb瘤内注射后各时间点的肿瘤%ID/g值均显著高于腹腔注射组和131I?IgG瘤内注射组，分别为后两组的1.4～17倍和1.7～3.7倍；各非瘤组织和器官的%ID/g值，除个别外（如第15天心）均小于后两组。131I?IgG瘤内注射组肿瘤％ID/g值在第1天显著高于131I?anti?CD20McAb腹腔注射组（P＜0.05），但第3天开始已降至较低水平，与后者比较无显著性差异（P＞0.05），见表2。131I表1131I标记物标记参数标记物 注：IgG:131I?IgG瘤内注射组； IT:131I?anti?CD20McAb瘤内注射组；IP:131I?anti?CD20McAb腹腔注射组与抗CD20单抗混合液经瘤内注射后肿瘤％ID/g值在24小时内从注射即时的192.4下降至0.6。

    2.3肿瘤累积吸收剂量给药后不同时间肿瘤累积吸收剂量，131I?anti?CD20McAb瘤内注射组均高于其他各组。其中给药后3天，该组肿瘤累积吸收剂量分别为腹腔注射组和131I?IgG瘤内注射组的12.6和2.1倍；给药后7天为6.0和2.5倍；给药后15天为7.0和1.5倍，见表3。表3各组给药后不同时间的累积吸收剂量组别累积吸收剂量（Gy）  第3天第7天第15天131I?IgG(IT)5.155.6513.99131I?anti?CD20McAb（IT）10.8313.9021.65131I?anti?CD20McAb（IP）0.862.323.09131I+anti?CD20McAb（IT）0.070.100.462.4放射免疫显像  给药后1、3和7天放射免疫显像，131I?anti?CD20McAb瘤内注射组肿瘤影像清晰，而腹腔注射组在整个过程中肿瘤影像均未显示；131I?IgG瘤内注射组仅第1天肿瘤影像清晰，第3天较模糊，第7天基本未能显示；131I+anti?CD20McAb瘤内注射组在第1天已无任何影像显示，见图1。

    3讨论多数临床研究结果表明，放射免疫采用传统的静脉给药难以达到足够的肿瘤治疗剂量[3,4]。采用肿瘤内直接注射标记单抗的方法是解决这一问题的有效途径之一。本实验旨在研究131I标记的抗CD20单抗经瘤内注射后在荷瘤裸鼠体内的组织分布和放射免疫显像，为下一步放射免疫治疗的实验研究奠定基础。以往的荷瘤裸鼠实验多采用静脉注射或腹腔注射给药，两者标记抗体的动态分布基本一致[5]。静脉或腹腔给药主要存在以下问题[6?8]：标记抗体进入血循环，可被血液稀释，被血中游离抗原中和；标记抗体难以通过血管壁进入肿瘤组织； 标记抗体进入机体正常组织，与其他组织形成非特异性结合。为了克服上述不利因素的影响，我们采用了瘤内注射的给药途径，与腹腔注射比较具有以下优点：（1）局部给药减少了全身对标记抗体的暴露，明显增加了标记抗体在肿瘤内的浓聚[9?12]。本实验中，131I?anti?CD20McAb经瘤内注射后肿瘤%ID/g值以注射即时最高，72小时内较快降至一定水平，表明抗CD20单抗与瘤细胞的结合是在注射后短时间内完成的。实验中各时间点的肿瘤累积吸收剂量，瘤内注射组高于腹腔注射组，充分显示了这一给药途径对提高标记抗体浓聚于肿瘤的作用。（2）瘤内注射可以将最高比放射性活度和免疫活性状态的标记抗体首先贡献给肿瘤，因此能够获得抗体与肿瘤的最佳结合和对肿瘤细胞的最强杀伤力。本实验131I?anti?CD20McAb瘤内注射组瘤内%ID/g明显高于腹腔

    图1荷瘤裸鼠注入131I标记物后体外放射免疫显像注射组，而各非瘤组织和器官的%ID/g值均低于腹腔注射组，充分说明瘤内注射这一治疗途径在保证疗效的同时，由标记抗体非特异性分布带来的毒副作用亦会显著下降。131I的β射线具有细胞杀伤作用，但以131I和抗CD20单抗单纯混合进行瘤内注射，由于131I不能特异性的定位于肿瘤组织，肿瘤％ID/g值在给药后24小时以内已降至0.6，肿瘤累积吸收剂量极低，起不到杀瘤作用，这一点也充分说明了放射性核素标记抗体是肿瘤放射免疫治疗的中心环节。总之，本实验结果显示，131I?anti?CD20McAb经瘤内途径给药可以使肿瘤获得最高的放射性药物摄取率，为下一步放射免疫治疗的动物实验研究奠定了基础。

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