放射性脑损伤实验兔模型的建立

           作者：官键 陈龙华 李志勇 李启生 刘英 王宏梅

【摘要】  目的建立能用于研究的放射性脑损伤动物模型。 方法选用40只新西兰兔作为动物实验模型，随机分为4组：10Gy、15Gy、20Gy 和30Gy组。分别在CT定位下建立三维重建图像资料，应用三维适形放射系统（3D?TPS）精确设计治疗计划、优化照射靶区剂量分布，照射体积约1cm×1cm×1cm，6MV X线单次大剂量照射。结果3D?TPS的剂量分布曲线显示，受照区域剂量分布均匀，95%的等剂量曲线包绕100%靶区体积，受照体积为(1±0.03)cm3。结论动物模型受照区域产生剂量均匀、准确，可用于研究放射性脑损伤。

【关键词】  动物模型； 放射性脑损伤； 适形放射治疗

    1材料和方法

    1.1动物及分组我校动物实验中心提供新西兰兔40只，体重4~4.5kg，随机分为4组：10Gy、15Gy、20Gy和30Gy组。

    1.2主要的实验仪器美国Marconi公司生产的Picker螺旋CT扫描仪器，德国Leibinger公司生产的立体定向框架；Leibinger和Marconi公司3D TPS工作站；美国Varian 2100C医用直线加速器一台；我校全军病理实验中心提供二氧化碳培养箱、全自动照相显微镜、恒温倒置显微镜、低温冰箱、低温高速离心机及切片机、日本JBM-1200EX透视电镜一台和日本日立公司S-450扫描电镜一台。

    1.3照射方法及剂量CT定位下以2mm层厚连续扫描新西兰兔头部，建立三维重建图像资料，应用三维适形放射治疗计划系统（Three dimensional conformal radiation therapy，3D?TPS）精确确定右大脑半球前1/4区域为照射靶区，照射体积约1cm×1cm×1cm。由物理师筛选射线入射方向，调整剂量分布，使95%等剂量曲线包绕100%靶区体积，并通过3D?TPS系统测定95%等剂量曲线覆盖的体积。将新西兰兔沿耳缘静脉注射3%苯巴比妥1.0ml/kg麻醉，以Varian2100C直线加速器采用6MV X线行单次大剂量照射，剂量分别为10Gy、15Gy、20Gy和30Gy。

    1.4照射后观察期间每周两次检查并记录新西兰兔的放射反应，神经系统定位体征。观察照射区域毛发与皮肤情况。分别在照射后2、4、6、8及12周定期检测放射性脑损伤的MRI变化情况，并处死每组2只实验动物，取照射区域脑组织行组织病理及电镜检测。

    1.5磁共振波谱（magnetic  resonance  spectoroscopy, MRS)检查分别在照射后2、4、6、8及12周定期检测放射性脑损伤的MRS变化情况。使用头颅正交线圈，点分辨波谱分析方法（PRESS）采用化学抑制水抑制法收集信号。体素参数为1.0cm3，取样时将体素置于高剂量靶区部分，分析N?乙酰天门冬氨酸（N?acetylaspartate，NAA）的峰值和比值。

    1.6统计学处理 将照射后测量的数值分别与照射前作配对t检验，比较照射后不同时间MRS与照射前是否有差异。

    2结果

    2.1照射后实验动物临床表现照射后的实验动物均有食欲减退，活动减少及困倦等，2周内开始出现早期脑损伤症状，表现为烦躁、呆滞或嗜睡等症状。30Gy剂量组3周后开始出现消瘦，动物出现局限性毛发脱落[5?7]。20Gy剂量组4周后开始出现上述反应，15Gy及10Gy剂量组则分别在7周及9周后出现类似症状。

    2.2神经系统定位体征照射30Gy剂量组观察至12周的2只动物均发生左侧肢体偏瘫；20Gy剂量组观察至12周出现左侧肢体肌力下降；15Gy及10Gy剂量组未出现上述症状。

    2.3受照区域剂量分布3D?TPS的剂量分布曲线显示，所有照射动物受照区域内剂量分布均匀，95%的等剂量曲线包绕100%靶区体积，受照体积为（1±0.03）cm3。

    2.4MRI变化情况30Gy单次照射组受照后8周出现MRI信号异常。20Gy剂量组受照后12周出现MRI信号异常。15Gy及10Gy剂量组随访至12周尚未出现MRI信号异常。T1加权成像病灶信号强度为低信号或等信号。T2加权成像病灶信号强度均为高信号，病灶直径≤1cm。Gd?DTPA增强扫描后可见环行强化或病灶不均匀强化影。各实验动物均无显示明显占位效应[8?10]。

    2.5MRS波谱变化受照后早期MRS中NAA峰值即可出现明显降低（P<0.05），单次照射剂量越大，MRS中NAA峰值降低越早，检测灵敏度越高，见表1。表1各组实验兔照射前后NAA波谱峰值注：P≤0.05差异有统计学意义；P＞0.05差异无统计学意义2.6病理变化

    2.6.1光镜所见各组实验兔早期（4周以内）均可见脑白质内血管周围性水肿，组织细胞水肿及炎症细胞浸润（主要是中性粒细胞），其中30Gy剂量组尚可见血管周围神经细胞变性坏死；中期（4~12周）胶质开始增生并形成结节状，部分小血管增生扩张成团，部分血管嗜纤维样变性，管腔变窄或闭塞，严重者出现脱髓鞘和散在性神经细胞凝固性坏死，且以小脑皮层浦肯野氏细胞和脑干椎状细胞坏死最明显，见图1；晚期（12周）各组先后出现脑膜和血管周围淋巴细胞、单核细胞浸润和小血管增厚[6，7]。

    2.6.2电镜所见各组实验兔早期（4周以内）均可见电镜下神经细胞线粒体肿胀脱基质，使线粒体嵴清晰，30Gy组可见部分线粒体嵴断裂，或线粒体气球样变，或毛细血管壁破裂，淤点状出血。约4周后神经元染色质边集，体积相对缩小，髓鞘分层分离形成空泡状结构，核周间隙增大，见图2，Niss氏小体消失，呈早期凋亡表现，以后水肿逐渐加重，毛细血管内皮细胞肿胀，血管腔变小，血管周围水肿明显，胶质细胞肿胀明显[7]。

    3讨论放射性脑损伤是头颈部恶性肿瘤放射最常见的并发症。建立一种剂量精确、均匀的放射性脑损伤动物实验模型，使实验研究更具有性、实用性，是进行放射性脑损伤实验研究最重要的环节之一。国内外迄今已经有大量的报道放射性脑损伤实验动物模型的建立。1991年Delapaz等[11]对家兔作半脑照射，建立了早期的放射性脑损伤模型。匹兹保大学以头部γ刀8mm限光筒对狒狒进行150Gy的照射，42周后尸检显示为典型的受照区域脑水肿和星形细胞增生，进一步证实了放射性脑损伤模型的建立。Buatti等[9]和Spiegelmann等[12]建立了以右侧内囊前肢为靶点的动物模型，Bernstein建立了F?344大鼠组织间插植照射额叶的动物模型，UCSF研究组对比格犬125I源植入右侧额叶脑白质，Coderre等[13]、Gavin等[14]和Shutter等[15]分别用大鼠、犬建立了硼中子俘获治疗（BNCT）模型，Kennedy等[16]、Brown等[17]建立了大鼠质子治疗的动物模型。国内也有学者研究建立放射性脑损伤实验动物，如苏州医学院附属二院建立的半脑照射实验动物模型研究放射性脑损伤。以往报道绝大多数都以大鼠全脑或半脑照射作为实验动物，且照射剂量不均匀，受照体积不精确，仅适用于放射性脑损伤的定性研究。随着放射性脑损伤实验研究的进一步深入，在实验动物的种类、剂量的精确均匀等方面有了更加严格的要求。NAA的降低，是目前公认的神经元损伤标志。Movsas等［18］比较了8例病人预防或治疗性全脑放疗前后全脑NAA值，发现放疗后NAA较放疗前明显降低，预测质子MRS分析NAA变化将有可能作为评价放射性脑损伤的最早期、敏感的指标之一。本研究为家兔脑行适形放射治疗建立的动物实验模型，在病变早期即观察到NAA降低，与Movsas结果一致，进一步证实了该动物实验模型的科学性。分析以家兔脑适形放射治疗建立的动物实验模型，其优势及意义如下：(1) 其解剖结构、大小均比大鼠更合理；(2) 应用立体定向三维适形放射治疗系统精确设计、优化治疗靶区剂量分布，使照射区域剂量更均匀、准确；(3) 通过三维治疗计划图象合成系统立体成像，精确受照区域的体积，比较受照区域与放射性脑水肿发生范围；(4) 准确勾画照射区域等剂量曲线，显示任意点照射剂量；(5) 可以改变射野角度及剂量权重随时调节等剂量曲线分布，符合各种照射区域的实验设计；(6) 可以比较不同等剂量曲线下脑组织病理、影像学等改变，研究放射性脑损伤的发生过程[19]。综上所述，本实验应用立体定向三维适形放射治疗计划系统建立的家兔放射性脑损伤实验动物模型是一种具有较强科学性、实用性的实验工具。通过该动物实验模型，可以更加准确、深入研究脑不同结构的放射生物学特性，是进一步研究脑病变精确放射治疗的基础。

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