凝血酶诱导非小细胞肺癌血管内皮生长因子分泌的实验

         作者：王盛兰 王熙才 伍治平 金从国 陈晓群 蒋永新 谷玉兰 陈艳 周永春 腾毅山

【摘要】  目的探讨凝血酶对非小细胞肺癌细胞株A549分泌血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）的促进作用及其机制。方法采用ELISA法检测凝血酶对A549细胞分泌VEGF的浓度以及水蛭素对其阻断作用。采用RT?PCR法检测凝血酶受体PAR?1在A549细胞中的表达。结果凝血酶在0.5～3U/ml的浓度范围内可以明显地增加VEGF的分泌，而＜0.5U/ml时这种促进作用则不明显，水蛭素能够完全阻断凝血酶的这种促进作用。PAR?1在A549细胞中表达，而在正常的胎肺细胞（KMB?17）中并不表达。结论在一定浓度范围内，凝血酶能有效地促进A549细胞VEGF的分泌，而这种促进作用可能与PAR?1受体的表达有关。

【关键词】  凝血酶； 水蛭素； 非小细胞肺癌； 血管内皮生长因子

    1材料与方法

    1.1主要材料Trizol试剂，购自天为时代生物有限公司；RT?PCR试剂盒、PCR试剂盒，由MBI公司生产；凝血酶冻干粉、重组水蛭素冻干粉，由SIGMA公司生产；人VEGF ELISA试剂盒，购自深圳晶美生物有限公司；RPMI1640培养基，购自GIBCO公司；新生小牛血清，购自医学生物工程研究所。 

    1.2方法

    1.2.1细胞培养   A549细胞于RPMI1640培养基+10%小牛血清,对数生长期收集细胞,调整细胞浓度为2×105/ml, KMB?17细胞于DMEM培养基+10%小牛血清培养。

    1.2.2ELISA方法检测VEGF的分泌（1） 标本收集肺非小细胞肺癌患者血清138份（包括腺癌57例、鳞癌68例、大细胞癌13例），保存于-20℃冰箱。（2） 细胞培养上清液的收集① 将A549细胞稀释到上述浓度，接种于24孔板，培养6h后细胞贴壁生长，更换细胞培养液同步24h。实验分组（每组8孔）：凝血酶0.5U/ml组、凝血酶1.0U/ml组、凝血酶3.0U/ml组、以1640培养液为空白对照，收集细胞培养上清液保存于-20℃。② 将A549细胞稀释到上述浓度，接种于24孔板，培养6h后细胞贴壁生长，更换培养液。实验分组（每组8孔）：凝血酶3.0U/ml细胞、凝血酶3.0U/ml细胞+3.0U/ml水蛭素、以1640培养液为空白对照，分别在6、16、24h收集细胞培养上清液保存于-20℃。(3) VEGF的测定按照人VEGF ELISA试剂盒说明进行测定,在实验中标准品和样本均双复孔检测。

    1.3逆转录聚合酶链式反应

    1.3.1细胞A549、KMB?17总mRNA的提取(1) 直接在贴壁生长细胞的培养瓶中加入Trizol（1ml/10cm2），用尖吸管反复吹打几次后，将裂解液移入EP管中，加入1/5  Trizol体积的氯仿，充分震荡，4℃ 12000g×5min；(2) 吸上层水相移入新管，加1/2体积的异丙醇，4℃ 12000g×10min去上清，沉淀用75%乙醇洗涤，-20℃放置20min, 4℃ 12000g×15min；(3) 去上清，室温干燥，4℃ 12000g×5min，沉淀溶于20μl  DEPC?dd  H2O中；(4)紫外分光光度仪测量OD值，分析浓度和纯度。

    1.3.2RT?PCR按检验试剂盒说明书分RT及PCR两步进行：① 分别加入5μg总RNA、cDNA合成引物酶抑制剂、dNTP、MMLV逆转录酶、DEPC?dd H2O，至终体积20μl，42℃×60min, 70℃×10min。② 加入PCR反应体系、上下游引物、超净水进行反应。循环条件：热启动94℃、30s；57℃、30s；72℃、1min，31个循环；延伸72℃、7min。扩增PAR?1 cDNA。PAR?1引物：上游引物5’?CCACAAACGTCCTCCTGATT?3’和下游引物5’?TGGGATCGGAACTTTCTTTG?3’，扩增片段大小为200bp。同时扩增β?action作为内参照物。引物序列为：5’?ACACTGTGCCCATC?3’和5’?AGGGGCCGGACTCGT?3’，PCR扩增产物长度为300bp。

    1.3.3电泳及成像经1.0%琼脂糖凝胶(1%溴化乙锭染色)电泳(75MV，40min)鉴定，凝胶成像分析系统观察、照相。

    1.4统计学处理数据采用统计学软件包SPSS12.0处理，（取均数±标准差）进行t检验、方差分析和LDS检验，P＜0.05为差异有统计学意义，趋势图采用EXCEL制作。

    2结果

    2.1凝血系统激活对肺癌患者的血管内皮因子分泌的影响实验发现，纤维蛋白原激活患者的血管内皮生长因子分泌较纤维蛋白原浓度在正常范围内2~4 g/L的患者明显升高, 凝血状态的激活与否与血管内皮生长因子的分泌有关（P<0.05），见表1。表1患者纤维蛋白原(Fgb)状态与VEGF浓度的关系    例数(人)Fgb(g/L)VEGF浓度(pg/ml)71＞4645.66±57.29*672~4499.91±51.21*：与纤维蛋白原浓度在正常范围内组别比较，P＜0.05，差异有统计学意义2.2凝血酶对A549细胞血管内皮生长因子分泌的影响凝血酶对A549细胞血管内皮生长因子分泌的促进作用呈剂量和时间依赖关系，24h时间段凝血酶在0.5~3U/ml的浓度范围内可以明显地促进VEGF的分泌（P<0.05），而＜0.5U/ml时这种促进作用则不明显（P＞0.05），见表2。表224h时细胞A549 VEGF分泌浓度比较   组别n（例数）VEGF浓度(pg/ml)凝血酶0.5U/ml8934.35±87.65*凝血酶1.0U/ml8980.35±91.56*凝血酶3.0U/ml81007.64±98.19*空白对照8838．99±73.11*：各组与空白对照组比较，P＜0.05，差异有统计学意义同时3U/ml凝血酶在测量的各个时间点（6、16、24h）对VEGF的促进作用都是显著的（P<0.05)，在24hVEGF的分泌量几乎是6h的3倍，而这种促进作用能被等摩尔浓度的凝血酶特异性抑制剂——水蛭素完全有效地阻滞（P>0.05), 见表3。

    2.3PAR?1  mRNAR的表达

    RT?PCR检测结果显示，高转移性的肺癌细胞A549的PAR?1  mRNA有明显的表达，而正常胎肺细胞KMB?17却没有 PAR?1 mRNA的表达，见图1。

    表3ELISA法检测凝血酶、水蛭素对VEGF分泌的影响  组别n（例数)VEGF浓度(pg/ml)6h16h24h空白对照8177.84±24.35648.6±70.67838.99±73.353U/ml凝血酶  8346.99±27.42b  793.52±76.12b1007.64±98.19b3U/ml凝血酶+3U/ml水蛭素8168.7±14.53a 612.3±45.13a798.11±69.17aa：与空白对照组比较，P＞0.05; b：与空白对照组比较，P＜0.05图1PAR?1扩增产物表达3讨论VEGF是已知最重要的促血管生成因子，几乎在所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆有过表达[3]。VEGF的表达与非小细胞肺癌组织中微血管密度呈正相关，VEGF的表达对肺癌的血管形成、转移起到重要作用[4]，因此，在此实验中，探讨凝血酶对非小细胞肺癌VEGF存在调控作用的可能性。在体内，检测凝血酶十分困难。在本项实验中，我们采用凝血酶的前凝物质——纤维蛋白原(Fgb)作为患者凝血系统被激活的指标，监测患者的凝血状态。将随机抽样的156例患者分为凝血正常（67例）和激活（69例）两组。实验发现，纤维蛋白原激活患者的血管内皮生长因子分泌较纤维蛋白原浓度在正常范围内的患者明显升高。同时在细胞水平， 0.05～10U/ml凝血酶可以明显上调A549肿瘤细胞VEGF的分泌，上调作用呈浓度、时间依赖关系，更高浓度凝血酶的作用尚待进一步研究，与我们观察到的上述临床现象一致。国外研究也表明凝血酶能有效提高恶性肿瘤——脑胶质瘤细胞株（U?87MG、U?105MG、U?251MG ）[5]和前列腺癌细胞株（DU145）VEGF mRNA及其蛋白的合成和分泌，并认为凝血酶诱导肿瘤细胞VEGF细胞因子合成和分泌与PI13和丝氨酸/苏氨酸激酶（ERP）提高了VEGF mRNA的稳定性有关[6,7]。研究表明绝大部分凝血酶效应是通过激活的凝血酶受体PAR?1介导的[8]。 本次体外实验结果发现， PAR?1在恶性程度较高的肿瘤细胞A549高表达， 而在正常的胎肺细胞株中却不表达。 通过凝血酶的特异性抑制剂——水蛭素， 使凝血酶对A549细胞的促进血管内皮生长因子的分泌作用被完全抑制， 说明了凝血酶作用的完全特异性及其受体具有生物学活性， 而不是孤立的。 用DNA重组技术生产的水蛭素是作用最强的特异性凝血酶抑制剂， 它与凝血酶以等摩尔比形成非共价键紧密结合的稳定产物， 从而使凝血酶失活。 PAR?1是凝血酶受体家族最重要的成员，在多种肿瘤组织或细胞株中均能找到不同程度的表达，而在正常上皮组织中表达量很少或缺乏[9]，孟宇宏等[10]也证实PAR?1在我国各种类型的人肺癌组织中均有不同程度的表达，并且表达量的高低与组织恶性程度有关。

【】
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[2]Zucker S, Mirza H, Conner CE, et al. Vascular endothelial growth factor induces tissue factor and matrix metalloproteinase production in endothelial cell: conversion of prothrombin to thrombin results in progelatinase A activation and cell proliferation[J]. Int J Cancer, 1998,75(2):780?786．

[3]陈景生, 史景泉. 肿瘤分子细胞生物学[M].第2版，北京：人民军医出版社， 2002.81?82．

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[5]Yamahata H, Takeshima H, Kuratsu J, et al.The role of thrombin in neo?vascularization of malignant gliomas：An intrinsic modulator for the up?regulation of vascular endothelial growth factor[J]. Int J Oncol，2002,20(5):921?928.

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[7]Liu J, Schuff?Werner P, Steiner M. Thrombin/thrombin receptor(PAR?1)?mediated induction of IL?8 and VEGF expre?ssion in prostate cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 343(1):183?189.

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