RNA干扰技术沉默STAT3对人肺癌细胞生长抑制的作用
【摘要】 目的探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对肺腺癌A549细胞的生长抑制作用。方法针对STAT3mRNA序列设计合成2对编码siRNA的DNA模板，构建pSUPER?siRNA?STAT3重组质粒，转染A549细胞；采用RT?PCR法检测重组质粒对STAT3基因表达的影响；在荧光显微镜下观察细胞的凋亡情况。 结果成功构建pSUPER?siRNA?STAT3重组质粒，并成功转染A549细胞。特异性siRNA片段能有效降低STAT3mRNA水平，最大干扰效率达85.32％，明显高于空质粒对照组；干扰作用于转染后24h即可出现，48h达高峰，72h降低。对应不同位点的两个siRNA片段对STAT3均可产生干扰作用，彼此间差别不大。在荧光显微镜下，与未转染细胞相比，转染siRNA的A549细胞中凋亡细胞所占比例明显增加。结论pSUPER?siRNA?STAT3可抑制STAT3在人肺腺癌A549细胞中的表达，并抑制肿瘤细胞的生长，促进其凋亡。以STAT3为靶点的RNA干扰技术可望成为肺癌基因的新方法。
【关键词】 肺癌；RNA干扰；STAT3；凋亡
Abstract：ObjectiveTo study the effects of pSUPER ?siRNA? STAT3 gene on the growth of A549 cells．MethodsTwo pairs of DNA template coding siRNA were synthesized against STAT3 to reconstruct pSUPER ?siRNA? STAT3．Which was transfected into A549 cells．The STAT3 expression in A549 were transfected with pSUPER ?siRNA? STAT3，and it was detected by RT?PCR and cells viability by fluorescence microscope.ResultsThe siRNA eukaryotic expression vector against STAT3 mRNA was successfully conctructed， which was transfected into A549 cells. The level of STAT3 mRNA in A549 cells was inhibited by the specific siRNAs．The decrease of STAT3 mRNA expression began to appear 24 hours after transfection．And the most apparent interfering efficiency was 85.32％,48 hours after transfection，which was markedly higher than that in the cells transfected with the control siRNAs．Both siRNAs from different loci had interfering effect on STAT3 mRNA expression，but there was no significant difference between them．Compared with those control cells ,the apoptotic rates were significantly higher in siRNA transfected cells by fluorescence microscope.ConclusionpSUPER?siRNA?STAT3 could significantly inhibit STAT3 expression，suppress the growth of A549 cells. The RNA interfering technique targeted on STAT3 may provide a new method in the gene therapy of lung cancer．
Key words：Lung cancer；RNAi；STAT3；Apoptosis
0引言
进入21世纪后，基因重组和靶向治疗为我们寻找新的肺癌治疗途径提供了前景，但是如何选择准确的靶点，目前仍存在很多技术问题。 研究发现，信号转导子和转录激活子3(STAT3)的过度激活及表达可导致细胞的无限生长，抑制凋亡，发生癌变,但主要限于血液肿瘤及头颈部实体瘤[1,2]。我们最近对NSCLC的研究也发现STAT3的过表达[3]。RNA干扰(RNAi)技术是以mRNA为靶点，在转录后使其沉默，不直接干扰DNA，具有特异、高效、简便快捷和小干扰RNA(siRNA)可在细胞间转移等特点[4?7]。本实验利用RNAi技术，针对STAT3基因的2个不同部位设计2对siRNA，用带有u6启动子的质粒pSUPER构建siRNA?STAT3表达载体，转染人肺腺癌A549细胞，阻抑STAT3基因的过度表达，诱导肿瘤细胞凋亡，初步探讨其作为治疗肺癌新的基因靶位的可行性。
1材料与方法
1.1材料siRNA片段:从STAT3基因编码区起始密码子下游寻找符合设计特征的靶序列（989?1007核苷酸碱基序列CATCTGCCTAGATCGGCTA与2144?2162核苷酸碱基序列GCAGCAGCTGAACAACATG），上述序列用BLAST软件进行同源分析证实为STAT3高度保守，采用化学合成法合成。主要试剂：带有u6启动子的质粒载体(pSUPER)及肺腺癌A549细胞均由四川大学华西提供，T4 DNA连接酶、EcoR II和HindⅢ限制性内切酶、质粒提取试剂盒及RT?PCR相关试剂由上海生工提供，E.coli DH5α感受态细胞由大连宝生物公司提供，脂质体(1ipofectamine2000)、Trizol试剂由Invitrogen提供。
1.2方法
1.2.1重组质粒pSUPER–siRNA–STAT3的构建及鉴定从GenBank中STAT3 mRNA(NM003150)上寻找符合特征的靶序列，合成分别针对其编码区碱基序列的两条DNA寡核苷酸链(分别为STAT3?1，?2，)，设计的寡核苷酸序列5’端和3’端分别含BglII和HindIII酶切位点。5’端开始为19个核苷酸的siRNA作用链序列，中间以9个核苷酸的TTCAAGAGA间隔形成发夹结构，最后为siRNA作用序列的反向重复序列；3’末端加有转录终止信号TTTTT。合成的两条互补寡核苷酸链在退火缓冲液作用下退火，形成双链结构。pSUPER经BglII和HindIII双酶切线性化，在T4 DNA连接酶的作用下与退火后形成的双链结构连接，形成pSUPER?siRNA?STAT3重组质粒。提取重组质粒进行PCR及测序鉴定。
1.2.2细胞培养及转染肺腺癌A549细胞1×106个分别接种于100ml培养瓶中，培养至80％～90％细胞融合。用无血清培养液洗3遍，将构建的重组质粒和pEGFP按20∶1的比例共转染(标记阳性转染细胞),与脂质体的混合物室温放置10min，与无血清培养液混合再放置10min，加入培养瓶中。将转染后细胞在37℃、5％CO2条件下培养24h后弃上清，加入10％培养液继续培养至48h、72h收获细胞，期间相差显微镜下观察细胞调亡情况。
1.2.3cDNA合成用Trizol提取细胞总RNA后，取10μg加入10mmol/L dNTP 5μl、5×第一链缓冲液10μl、RNase Inhibitor 2.5μl、随机引物5μl、反转录酶SuperScriptⅡ 2.5μl，加DEPC处理水至5０μl，42℃ 反应50min。向第一链反应混合物中加入10×第二链缓冲液25μl、E.coli DNA Pol 4μl、E.coli RNase H 1μl、E.coli DNA Ligase 1.5μl，加ddH20至总体积250μl，12℃ 1h，22℃ 1h，加入2.5μl 0.5mol/L EDTA中止反应；用酚:氯仿(25∶24)抽提1次，乙醇、醋酸钠沉淀后溶于10μl ddh2o中。
1.2.4荧光探针RT?PCR扩增与分析按试剂盒操作说明进行，总反应体系50μl，93℃变性3min后按如下条件进行循环：93℃30s、55℃45s，共45个循环。实验结果由电脑自动保存并分析。
2结果
2.1重组质粒的鉴定
2.1.1菌落PCR验证阳性克隆在pSUPER载体上设计PCR的引物，上游设计在插入片段之前，下游设计在插入片段之后，如果是空载体，扩增片段为246bp,如果是阳性克隆，即插入了64个碱基，则扩增片段为310bp（见图1），第1和第7泳道为阳性克隆。
图11％普通琼脂糖电泳结果（略）
2.1.2测序结果经上海生工生物工程技术服务有限公司测序，进一步证实重组载体序列正确。
第1条链GGGCCCGGCGGGAACACCCAGCGCGCGT GCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGAGGGACAGGGG AGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGTCGCTATGTGTT CTGGGAAATCACCTAAACGTGAAATGTCTTTGGATT TGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACAGATC CCCCATCTGCCTAGATCGGCTATTCAAGAGATAGCCGATC TAGGCAGATGTTTTTGGAAA......
第2条链GGGCCCAGTGTCACTAGGCGGGAACAC CCAGCGCGCGTGCGCCCTGGCAGGAAGATGGCTGTGA GGGACAGGGGAGTGGCGCCCTGCAATATTTGCATGT CGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAA TGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATG AGACCACAGATCCCCCATCTGCCTAGATCGGCTATTCAAG AGATAGCCGATCTAGGCAGATGTTTTTGGAAAA......
2.2RNA干扰的特异性、时效性及靶向位点性与空白对照组、空质粒对照组对比，RT?PCR检测发现，对照组STAT3 mRNA无明显变化，而重组质粒组含量明显下降，两条链最大干扰效率分别达75.00%、82.32%；于转染后24h，STAT3 mRNA的含量已出现下降，最大的干扰作用出现在48h,72h后STAT3 mRNA的表达水平略有回升，但两条链的干扰效率无明显差异（图2）
图2STAT3 mRNA分析结果（略）
2.3A549细胞凋亡敏感性与对照组相比，重组质粒组细胞发生了明显变化，从相差显微镜下观察，可见对照组细胞贴壁生长，状况良好，多为梭形，大小适中，核仁清晰，核分裂相明显；siRNA?STAT3组细胞数量明显减少，形态不规则，细胞核皱缩，颗粒增多，细胞碎片增加，细胞凋亡随着时间推移更加明显，图3略。
3讨论
STAT3是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白。人们最初发现在v?src诱导的NIH3细胞分化过程中，STAT3的激活是不可缺少的条件，其过度激活及表达通过对抗凋亡导致肿瘤细胞生长失控。目前针对STAT3靶基因的反义技术及显性负性蛋白在体内的表达已成功地诱导了肿瘤细胞凋亡，这在多发性骨髓瘤、黑色素瘤、头颈部肿瘤及头颈部鳞状细胞癌中已得到证实[8?9]。我们的研究发现STAT3蛋白在肺癌组织中有异常表达，但其对肺癌细胞的凋亡情况尚未见报道。在本研究中，我们采用RNA干扰技术，将对应STAT3的siRNA片段成功转染入肺腺癌A549细胞株，在mRNA水平上封闭其表达，并观察了转染前后A549细胞STAT3基因表达的变化及细胞的凋亡情况。结果表明，与对照组和空载体转染组相比，转染siRNA序列的A549细胞STAT3基因水平明显降低。细胞凋亡明显增加，研究结果提示STAT3有可能成为未来肺癌的潜在性靶点。研究结果也充分证实了RNA干扰的高度特异性：转染对应STAT3的siRNA片段可特异性降低目的基因的mRNA水平，而转染空质粒却几乎不产生任何干扰作用。但对应某一基因可能设计出许多对siRNA，而并非所有的片段都能产生高效的沉默作用。因此，设计、选择最佳的siRNA片段成为了RNA干扰研究的关键点之一。在本实验中两条针对STAT3基因设计的siRNA链转染入A549细胞48h后，干扰效率分别为75.00%、82.32%，这提示对应这2个不同位点的siRNA片段均具有一定强度的基因沉默功能。Abedini等将对应STAT3基因另3 b4个不同位点的siRNA片段转染入人类卵巢癌细胞株，也达到了较好的封阻效果．但这种封阻能力的相接近性是否与细胞类型、STAT3的表达水平等因素有关，还有待于进一步探讨。综上，我们的实验初步证实了以STAT3为目的基因，通过RNAi技术可特异性地抑制其在肺腺癌A549细胞中的过度表达及诱导肿瘤细胞凋亡有可能成为未来肺癌治疗的潜在性靶点。但作为实验手段的RNAi技术的分子机制目前仅被初步了解，虽在基因功能、疾病治疗等研究方面有成功应用，但仍有许多问题尚需进一步解决。如：如何选择最合适靶序列；如何把它高效的转入动物、甚至患者体内等等，都还需要更深的探索研究。
【】
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