survivin反义寡核苷酸逆转顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡耐受作用
【摘要】 目的探讨survivin反义寡核苷酸逆转人肺腺癌细胞对顺铂诱导的细胞凋亡耐受的效应。方法1.常规体外培养A549/CDDP细胞，以脂质体包裹的survivin 反义寡核苷酸（ASODN）体外转染细胞。2.采用二苯胺反应法（DPA）测定DNA片段化、激酶法检测Caspase?3酶活性及流式细胞术检测细胞凋亡率（AI），评价细胞凋亡程度。3.采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率，半效抑制浓度（IC50）及耐药倍数（RI）。结果 1.单用ASODN转染组DNA片段化比率、细胞凋亡率和Caspase?3相对活性分别增高至(43.55±6.07)%、 (34.03±2.25)%和1.1298±0.2502，和各对照组相比较，均有显著性变化（P<0.01）；而ASODN和CDDP联用组上述凋亡指标增高更为明显，分别达（76.73±2.04）%、（65.85±5.47）%和1.6805±0.2758（P<0.05）。2.转染组A549/CDDP细胞生长抑制显著，单用转染组和联合CDDP组生长抑制率分别增高达59.3%和83.7%（P<0.05）。3.ASODN转染后CDDP对细胞IC50由(225.03±10.59)μmol/L减低至(158.84±4.256)μmol/L，其RI由11.9减为8.39。结论survivin 反义寡核苷酸体外转染可降低耐顺铂人肺腺癌细胞的凋亡阈值，从而较大程度上逆转其对顺铂诱导的细胞凋亡耐受。
【关键词】 survivin基因；反义寡核苷酸；多药耐药性；细胞凋亡
related factors, such as bcl?2 family and inhibitor apoptosis family proteins(IAPs),can result in inhibition of apoptosis induced by chemotherapy agents and thereby confer to drug resistance in malignancies. Regulation of those gene expressions may reverse the apoptosis resistance to chemical agents. In the present study, we transfect cisplatin?resistant human lung adeno?carcinoma A549/CDDP cell lines to explore whether antisense oligodeoxynucleotides(ASODN) targeting survivin gene can reverse apoptotic resistance induced by cisplatin in human lung adenocarcinoma cells. MethodsA549/CDDP cell lines were cultured routinely with RPMI?1640 medium. survivin ASODN mediated by cytofectin was transfected into the A549/CDDP cells .The influence of ASODN transfection on apoptosis was determined by Diphenylamine assay（DPA），caspase?3 colorimetric assay and flow cytometry. 3?（4，5?dimethylthiazol?2?yl）?2，5?diphenyl tetrazolium bromide （MTT） assay was performed to detect the cell viability , half?maximum inhibitory concentration (IC50) and cisplatin resistant index(RI) was thereby calculated, respectively.ResultsIn the A549/CDDP cells transfected by survivin ASODN for 48 hr， the percentage of DNA fragmentation, apoptotic index and Caspase?3 activity was enhanced to (43.55±6.07)%， (34.03±2.25)% and 1.1298±0.2502，respectively (P<0.05), it was obviously significant,compared to the controls. While combination with ASODN and 10μmol/L cisplatin caused far more obvious apoptotic alterations in the cells, of which the percentage of DNA fragmentation, AI and Caspase?3 activity was reached to（76.73±2.04）%，（65.85±5.47）% and 1.6805±0.2758（P<0.05）,respectively,and even compared to single ASODN group, it was still significant （P<0.05）. Transfected with survivin ASODN single and with combination of cisplatin for 48hrs,the rate of cell growth inhibition in the resistant cells was enhanced to 59.3% and 83.7%,respectively（P<0.05）, while cell viability inversely had the lowest reduction. And the half?maximum inhibitory concentration of cisplatin was reduced from 225.03±10.59μmol/L to 158.84±4.256μmol/L,while the resistant index was conversely reduced from 11.9 to 8.39.Non?sense oligodeoxynucleotides(NSODN) and liposome had no effect on the cells（P>0.05）.ConclusionTransfection of antisense oligodeoxynucleotides targeting survivin gene can reduce the apoptosis threshold, thereafter to great extent reverse apoptotic resistance induced by cisplatin in cisplatin?resistant human lung adenocarcinoma in vitro.
Key words：survivin gene； Antisense oligodeoxynucleotides；Multidrug resistance； Apoptosis
0引言
顺铂是肺癌化疗中的常用药物，诱导细胞凋亡是其抗肿瘤的主要作用机制。然而，由于耐药的产生，限制了其临床疗效的发挥。因此，寻找有效的方法逆转肺癌顺铂耐药性，是突破含顺铂肺癌化疗方案疗效平台产生的有效途径之一，并有望改善肺癌患者的远期生存期。本研究以survivin为靶点，将人工合成的反义寡核苷酸体外转染耐顺铂人肺腺癌A549/CDDP细胞，探讨其对顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡耐受的影响。
1材料与方法
1.1细胞株人肺腺癌敏感细胞株A549，耐顺铂人肺腺癌细胞株A549/CDDP，均购自湘雅医学院细胞中心。
1.2主要试剂RPMI?1640培养基为Hyclone公司产品。溴化二甲基噻唑二苯四氮唑（MTT）为美国AMRESLO公司产品。焦碳酸乙二酯、碘化吡啶、Triton X?100购自Sigma公司。survivin ASODN 及无义链（N?ODN）由上海生物工程有限公司合成。Caspase?3试剂盒为BioVision公司产品。RNAse A为GIBCO公司产品。余均为国产分析纯试剂。
1.3细胞培养人肺腺癌敏感细胞系A549和耐顺铂细胞亚系A549/CDDP培养于含10％新生小牛血清的RPMI?1640培养液中，每毫升培养液含青霉素/链霉素均为100U，用5％Na2CO3调节PH值为7.2～7.6，置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3天用0.25％的胰蛋白酶消化传代。
1.4体外细胞转染预试验转染条件优化结果显示，A549/CDDP细胞铺板达80%左右， survivin ASODN浓度400nmol/L，脂质体（Liposome，Lip）剂量为5μg/L，作用48h该细胞转染效率最高，因此，以此条件进行细胞转染实验。将5×106/ml细胞接种至六孔培养板，待细胞融合达到60％～80％开始实验。实验分组如下：（1）ASODN? Lip组：予400nmol/L ASODN? Lip复合物1000μl转染细胞。（2）NODN? Lip组：予等量（400nmol/L）的NODN? Lip复合物转染细胞。（3）ASODN? Lip +CDDP组：予400nmol/L ASODN? Lip复合物转染细胞，6hr后补加新鲜的RPMI? 1640时加入终浓度为10μmol/L的CDDP处理细胞。（4）NODN? Lip +CDDP组：予等量的NODN? Lip复合物转染细胞，余处理同试验组（3）。（5）Lip组：予等量RPMI?1640代替ASODN，加入上述组别等量的脂质体转染细胞。（6）Lip＋CDDP组：在Lip组的基础上加用终浓度为10μmol/L的CDDP处理细胞。（7）CDDP组：予等量的RPMI ?1640代替转染复合物处理细胞，并加入终浓度为10μmol/L的CDDP。（8）空白对照组：加等量的RPMI?1640处理细胞。每组设4个复孔。细胞转染操作按转染试剂盒说明书进行。
1.5二苯胺反应法测定DNA片段化比率取各组细胞制成单细胞悬液1ml。1000r/min，离心5min，去上清液，加低渗性细胞裂解液250μl重悬， 13 000r/min，离心10min，吸取上清液移入另一个EP管。分别向上清液管和沉淀管中加入25％和12.5％三氯乙酸，混匀后置44℃过夜。次日13 000r/min，离心10min，再分别向上述EP管中加入5％三氯乙酸80μl重悬细胞，混匀，90℃水浴30min。2 000r/min，离心10min。加入二苯胺反应液 250μl和高氯酸20μl，50℃水浴2h。将各组样品置酶标仪上测定吸光度值OD405nm。根据以下公式计算DNA片段化比率：DNA片段化比率（％）＝上清液OD405nm/（上清液OD405nm+沉淀OD405nm）×100％。
1.6流式细胞术检测细胞凋亡率收集各组细胞，1 000r/min，离心 5min，弃上清液，加入4℃预冷的70％乙醇，轻轻吹打混匀，置4℃固定24～72h。离心，去固定液，PBS洗涤，1 000rpm离心5min，调整细胞浓度为1×106/ml，再次离心，去上清液，加碘化吡啶溶液（PI）染液1ml，使其终浓度为5mg/ml，4℃避光染色30min。置FACSSort型流式细胞仪上，在激发波长为488nm处进行检测，将所得数据资料输入计算机，并应用相应的分析软件进行资料的处理和分析，细胞凋亡比率AI按以下公式计算：AI（%）=亚二倍峰细胞数/细胞总数×100%。
1.7激酶法检测caspase?3活性按试剂盒（BioVision公司）提供的操作说明书进行实验：收集上述经相应处理的各组细胞，PBS洗涤1次，1 000g离心5min，弃上清夜，加入细胞裂解液，冰上孵育10min，1 000g离心5min，取上清液50μl，同时加2×反应缓冲液和5μl的偶联底物，37℃水浴1h，于酶联检测仪上测定405nm波长的吸光度值（OD），以此值代表Caspase?3的相对活性。
1.8MTT比色法测定细胞活力和耐药性收集对数生长期细胞，接种细胞至96孔培养板上 (5×103个细胞/孔)，置37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养24h。按实验分组要求处理24h后，每孔加入MTT应用液（5mg/ml）10μl，继续培养4～6h。加入DMSO 200μl/孔，置振荡仪上振荡10～15min，使甲瓒蓝颗粒完全溶解。置酶标仪上测定吸光度值（OD），检测波长为570nm，按以下公式分别计算A549和A549/CDDP的细胞存活率，并利用直线加权回归方程分别求得A549和A549/CDDP对CDDP的半效抑制浓度（IC50）。细胞存活率（％）＝实验组OD570nm /对照组OD570nm×100％ 细胞生长抑制率（％）＝1－细胞存活率耐药指数＝A549/CDDP的IC50÷A549的IC50
1.9统计学方法所得数据均以均数±标准差（±s）表示，各试验组与对照组以及试验组之间的两两比较采用最小显著差法（the least significant difference,LSD）分析；经SPSS11.5统计软件包处理，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有统计学意义。
2结果
2.1survivin ASODN对A549/CDDP细胞DNA片段化比率的影响含ASODN转染组在不同时间点的DNA片段化比率均增高，以48h最为显著，单用ASODN组为（43.55±6.07）％，ASODN和CDDP联用组为（76.73±2.04）%，和各对照组相比较，差异均有显著性，P<0.05。和单用CDDP组及单用ASODN组比较，ASODN和CDDP联用组该比率亦显著增高，P<0.05,见图1。
2.2survivin ASODN对A549/CDDP细胞凋亡率的影响流式细胞仪检测结果显示，ASODN在不同时间点均可诱导A549/CDDP细胞凋亡，仍以48h最为明显，单用ASODN组细胞凋亡比率为（34.03±2.25）%，和对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。而ASODN和CDDP联用组其细胞凋亡比率最高可达（65.85±5.47）%，和CDDP组、NODN+CDDP组及Lip＋CDDP组相比较，差异均有统计学意义，P<0.05，见图2。
图1各组A549/CDDP细胞DNA片段化比率的比较（略）
图2各组A549/CDDP细胞凋亡比率的比较（略）
2.3survivin ASODN对A549/CDDP细胞Caspase?3活性的影响细胞凋亡的生化特征之一是Caspases酶活性的变化，Caspase?3是细胞凋亡Caspases酶级联放大反应过程中的一个重要的下游效应因子，通过检测该酶活性的变化，可作为反映细胞凋亡的一个重要参数。激酶法检测结果显示，含ASODN转染组在不同的时间点均可使A549/CDDP细胞Caspase?3相对活性增高，以48h增高最为显著，单用ASODN转染组其相对活性为1.1298±0.2502，和NS组、NODN组及Lip组相比较，差异均具有统计学意义（P<0.05）。ASODN和CDDP联用组其相对活性更高，达1.6805±0.2758，与CDDP组、NODN+CDDP组及Lip＋CDDP组相比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。和单用ASODN组相比较，差异亦有统计学意义（P<0.05），见图3a、3b。
2.4survivin ASODN对A549/CDDP细胞活性的影响A549/CDDP细胞经ASODN转染24h、48h和72h后，应用MTT比色法检测其吸光度值，并出细胞的存活率和生长抑制率（1-细胞存活率）。
表1ASODN转染对A549/CDDP生长抑制率的影响（略）
注：（1）和CDDP组比较：a，P>0.05,b，P<0.05；（2）和Lip组比较：c，P>0.05,d，P<0.05；（3）和NODN组比较：e，P>0.05,★，P<0.05；（4）和Lip＋CDDP组比较：▼，P>0.05,▲，P<0.05；（5）和NODN＋CDDP组比较：Δ，P<0.05；（6）和ASODN组比较：*P<0.05
结果显示，单用ASODN转染即可抑制A549/CDDP细胞的生长，其抑制生长效应在24h开始增高（37.25±2.21)%，48h达高峰（59.3±3.09)%，但72h反而开始减弱，但仍高于对照组（P<0.05）， ASODN和CDDP联用后，生长抑制效应更为显著，其细胞生长抑制率最高达(83.7±3.04)％（P<0.05），见表1、图4。
图3a各组A549/CDDP细胞caspase?3活性的比较（略）
图3b转染组A549/CDDP细胞caspase?3活性时效比较（略）
2.5survivin ASODN对A549/CDDP细胞耐药性的影响ASODN和5个梯度浓度的CDDP联合使用，经MTT检测发现，ASODN转染组A549/CDDP细胞对顺铂的半效抑制浓度IC50为（158.84±4.256）μmol/L，对顺铂的耐药指数为8.39倍，而对照组IC50及耐药指数分别为（225.03±10.59）μmol/L和11.9倍，而NSODN组和Lip组的IC50及耐药倍数均无明显改变(P>0.05),见表2。
图4各组细胞生长活力的比较（略）
表2ASODN转染对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/CDDP耐药性的影响（略）
注：和CDDP对照组比较：Δ，P>0.05;*，P<0.05; a和Lip或NODN组比较，P<0.05;b和Lip组比较，P>0.05
3讨论
细胞凋亡的抑制在肿瘤发生及耐药形成中具有重要作用。肿瘤细胞可通过增高凋亡阈值，降低对凋亡刺激因子诱导的细胞凋亡敏感性，或在小剂量化疗药物作用下，以“凋而不亡”的形式逃逸细胞凋亡的损伤，从而导致细胞凋亡耐受的发生[1,2]。业已证明，凋亡抑制蛋白（Inhibitor apoptosis proteins，IAPs）可以抑制细胞凋亡。IAPs家族中的某些成员可以直接抑制caspases级联反应末端效应子的活性，从而保护肿瘤细胞免受凋亡损伤。survivin是IAPs家族中分子量最小的成员，是迄今发现的最强凋亡抑制因子。足叶乙苷、阿霉素等多数化疗药物可通过活化caspase?3而诱导细胞凋亡；研究表明，survivin过表达可抑制足叶乙苷、阿霉素等诱导的细胞凋亡，并有可能作为耐药因子预示这类化疗药物的耐药形成[3,4]。利用反义药物下调肺癌细胞中survivin表达，可增加足叶乙苷的化疗敏感性,并可逆转耐阿霉素人白血病细胞的多药耐药性[5，6]。在耐顺铂的人胃癌细胞中，survivin表达明显上调，提示survivin对其顺铂耐药形成中具有重要作用，并可作为顺铂反应的一个预后因子[3]。因此，survivin过表达与肿瘤耐药形成有关，并有可能成为肿瘤治疗的理想分子靶点。DNA分子片段化是细胞凋亡的重要特征之一。因此，通过DNA片段化分析可以反应细胞凋亡。本研究利用二苯胺反应法对细胞DNA片段化进行定量分析，结果显示，单用survivin ASODN即明显促进了耐顺铂肺腺癌细胞DNA片段化，而和顺铂联合作用后，其DNA片段化作用更为明显。流式细胞术分析结果表明，单用survivin ASODN使耐顺铂肺腺癌细胞的凋亡指数增加达（34.03±2.25）%，而联用顺铂组则高达65.85％左右，和对照组相比较，均具有显著性变化（P<0.05）。对Caspase?3相对活性的检测结果也显示，含ASODN转染组在不同的时间点均可使A549/CDDP细胞Caspase?3相对活性增高，以48h增高最为显著，单用ASODN转染组其相对活性为1.1298±0.2502（P<0.05） ，ASODN和CDDP联用组其相对活性更高，达1.6805±0.2758。以上结果表明，单用ASODN自身即可明显诱导耐顺铂人肺腺癌细胞凋亡，而和顺铂联用后，细胞凋亡更为明显，可见ASODN还可促进顺铂诱导的肺腺癌细胞凋亡。 进一步分析发现，含ASODN转染组的细胞生长抑制明显。单用ASODN组其细胞生长抑制率显著增高（P<0.05），而和顺铂联用组其生长抑制率则高达(83.7±3.04)％（P<0.05）。同时，survivin ASODN转染使顺铂对A549/CDDP细胞的半效抑制浓度由（225.03±10.59）μmol/L下降至（158.84±4.256）μmol/L，而耐药倍数相应的由11.9下降至8.39，因此，survivin ASODN在使耐顺铂人肺腺癌细胞的凋亡阈值下调的同时，对细胞生长产生了显著的抑制作用，并使细胞对顺铂的耐药性产生了较大程度的逆转。
本研究结果显示， survivin 反义寡核苷酸体外转染可降低耐顺铂人肺腺癌细胞的凋亡阈值，从而较大程度上逆转其对顺铂诱导的细胞凋亡耐受，提示survivin与肺癌顺铂耐药形成有关。针对survivn的反义策略，可以下调细胞凋亡阈值，提高细胞凋亡程度，增加细胞对化疗药物的敏感性，这无疑为克服肺癌顺铂耐药提供了一个新的有效分子靶点。
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