smad4 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

            作者：吴鹏，田媛，桂伶俐，陈刚，卢运萍，周剑锋，马丁

【摘要】  目的针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4 shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil?1中,构建smad4 shRNA表达载体pGenesil?smad4?shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418 筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果3个smad4 shRNA 表达载体pGenesil?smad4?shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT?PCR、Western blotting均证实: 3种shRNA重组质粒中pGenesil?smad4?shRNA2可明显降低细胞内smad4 mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论成功构建了smad4 shRNA表达载体pGenesil?smad4?shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。

【关键词】  宫颈癌; shRNA; smad4

　　Abstract：Objective To explore the feasibility of selective inhibiting smad4 expression using smad4 short hairpin RNA (shRNA) interference. MethodsThree 19bp reverse repeated motifs targeting of smad4 gene were synthesized and cloned into eukaryotic expression plasmid pGenesil?1 containing U6 shRNA promoter and termination signal of RNA polymerase. The recombinant plasmids pGenesil?shRNA1, 2, 3 and pGenesil?con were transfected into HeLa cells respectively by lipofectamine reagent. The alteration of smad4 expression was examined by RT?PCR and Western blot. ResultsIt was verified by partial nucleotide sequencing and restriction endonuclease digestion that the constructed eukaryotic vector expressing shRNA of smad4 was correct. shRNA2 in pGenesil?smad4 cells knocked down the expression of smad4 mRNA and protein dramatically compared with untransfected and control cells. ConclusionThe shRNA can efficiently suppress smad4 expression in HeLa cells. The results of the study lay the foundation for further studying on biological functions and potential application of smad4.

　　Key words：Cervical cancer; shRNA; smad4

　　0引言

　　TGF?β/smads 信号转导通路是由TGF?β超家族、TGF?β受体、smads蛋白家族及其核内转录调节因子组成的肿瘤抑制通路。通路中任何元件异常都可以引起TGF?β/smads 信号转导紊乱,从而导致肿瘤的发生。而smad4是调节转录和TGF?β抗增殖应答的核心分子,在肿瘤中的灭活表明它是抑癌基因，smad4突变或表达丢失与多种肿瘤的发生有关。因此，我们构建了针对smad4的特异性短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体,转染宫颈癌细胞株HeLa,得到了基因表达抑制作用较强的永久干涉细胞克隆，为研究宫颈癌细胞的恶性生物学行为奠定基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料真核表达质粒载体pGenesil?1购于武汉晶赛生物技术有限公司，宿主菌DH5α为北京天为时代公司产品。宫颈癌细胞株HeLa购于典型物保藏中心。各工具酶为Takara公司产品；Lipfecti?namine2000脂质体转染试剂盒为Invitrogen公司表1smad4和18sRNA real time PCR引物序列Geneprimer  sequencelengthForward  5'?TGGCCTGTTCACAATGAGCTT?3'smad4Reverse  5'?ACCAATACTCAGGAGCAGGATGA?3'85Probe  5'?(FAM) CATTCCAGCCTCCCATTTCCA(TAMRA)?3'Forward 5'?AGTCCCTGCCCTTTGACACA?3'18sRNAReverse 5'?GATCCGAGGGCCTCACTAAAC?3'69Probe 5'?(FAM)CGCCCGTCGCTACTACCGATTGG(TAMRA)?3'产品。

　　1.2引物smad4和内参照18s RNA的RT?PCR引物序列见表1。

　　1.3smad4 短发卡式RNA (shRNA)的设计采用clontech在线设计软件选择smad4 cDNA序列上3个部位作为目标序列，同时将选中的shRNA中的碱基序列打乱设计为阴性对照,对照序列经BLAST检测证实与smad4 mRNA及其他基因编码序列无同源性。为鉴定设计片断是否插入载体，polyT后加上sal I的鉴定酶切位点。以上序列由上海英骏生物技术有限公司合成，序列见表2：

　　表2smad4 shRNA 干扰序列（略）

　　1.4smad4 shRNA表达质粒的构建用50μl annealing buffer溶解上述单链目的基因片段. 各取2μl单链和16μl annealing buffer, 94℃退火冷却至室温。T4 DNA连接酶将准备好的插入片断连接到纯化质粒pGenesil?1的Bam H I和Hind III之间, 16℃过夜, 构建成对照载体pGenesil?con和smad4 shRNA表达载体pGenesil?smad4 shRNA，转化至DH5α感受态细菌,涂于含卡那霉素的培养板中, 37℃培养过夜。随机挑选卡那霉素抗性的转化克隆摇菌扩增。

　　1.5smad4 shRNA表达质粒的鉴定提取的质粒经sal I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,判断酶切产物大小。并将阳性克隆送上海英骏生物技术公司测序，以鉴别插入片断是否含有碱基突变。

　　1.6smad4 shRNA转染HeLa细胞  用脂质体Lipfectinamine 2000将重组阴性对照载体pGenesil?con、pGenesil?smad4?1、2、3分别转染宫颈癌细胞株HeLa，命名为H/CON,H/shRNA1、2、3,并以HeLa细胞作为空白对照。在转染第2天将细胞以1∶10的稀释比例传代培养, 两天后用含800μg/ml G418的选择培养液连续培养2周,隔天换液一次,有限稀释法挑选单个抗性细胞在G418(200μg/ml)下常规培养扩增。

　　1.7流式细胞仪和荧光显微镜检测转染率  取HeLa、HeLa/con和HeLa/shRNA1、2、3细胞各1×106 个,制成单细胞悬液后流式细胞仪检测104 个细胞的相对荧光强度(RFI)和荧光表达率(其激发波长475nm,发射波长490nm)。取细胞常规铺片,置于荧光显微镜下观察并转染率。转染效率(%) =(发出绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数)×100%。

　　1.8转染细胞smad4 mRNA的检测

　　1.8.1RT?PCR检测smad4 mRNA水平  本实验以18sRNA作为内参照。TRIzol提取细胞总RNA,取2μg RNA作逆转录,反应体系25μl, dNTP(10mmol/L) 1μl, random primer（0.3μg/μl） 2μl,逆转录酶12U,RNA酶抑制剂20U, 5 ×逆转录缓冲液5μl。42℃ 1h, 95℃ 5min灭活逆转录酶，加无核酶水稀释5倍。在stratagene MP3000 (美国stratagene 公司) 实时荧光定量PCR 仪上进行实时定量扩增：反应体系25μl ,包含上、下游引物各0.4μmol/ L , TaqMan 探针0.2μmol/L , 2×TaqMan PCR 通用共同组分(Takara公司)12.5μl，1μl cDNA。PCR反应条件为第一步:95℃ 10min 1个循环;第二步:95℃ 15s，60℃ 15s，45个循环。

　　1.8.2RT?PCR 结果的分析本实验[1]采用相对定量来检测smad4在实验组和对照组表达的差异，采用18s RNA作为内参照，根据PCR扩增曲线，得到每个样本的Ct值,根据公式：Y=2-ΔCt, ΔCt=[实验组( Ct目的－Ct内参)]－[对照组( Ct目的－Ct内参)]算出转染组相对于对照组的干扰效率。

　　图1质粒鉴定重组（略）

　　A:sa1Ⅰ单酶切鉴定；B：碱基测序鉴定

　　1.9免疫印迹法检测smad4 蛋白表达  将HeLa细胞和转染的H/CON、H/shRNA1、 2、3细胞每组收集1×106个细胞,提取蛋白,Bradford法定量, 每孔80μg上样量, 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF膜,分别用兔抗人β?actin（1∶500）和鼠抗人smad4抗体(1∶200)杂交,4℃过夜后洗膜后再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或鼠IgG(1∶1000)二抗孵育2h, ECL显色,暗室曝光显影成像。

　　1.10统计学方法采用SPSS 10.0统计软件处理。组间比较采用方差分析。

　　2结果

　　2.1载体构建的鉴定  随机挑选卡那抗性的转化克隆,每种重组体各挑取2个克隆，提取质粒,由于pGenesil?1载体上含有sal I酶切位点,加上插入片断上引入的sal I酶切位点,采用sal I 酶切即可鉴定是否成功插入设计序列。如图1A所示: pGenesil?con，pGenesil?smad4 shRNA1、 2、3均含有410bp的插入片断。将pGenesil?con， pGenesil?smad4 shRNA1、2、3各挑取一个克隆送测序，测序结果证实设计序列正确插入载体中且无突变，重组载体克隆成功，见图1B。

　　2.2重组质粒转染效率的检测  HeLa细胞转染48小时后,荧光显微镜检测显示与未转染的HeLa细胞相比,实验组HeLa/shRNA1、2、3和对照组HeLa/con细胞中均有较大比例的细胞表达绿色荧光蛋白，见图2,流式细胞术检测HeLa/shRNA1、2、3和对照组HeLa/con转染效率分别为58.2%,64.6%,57.3%和56.1%,证实重组质粒获得较高转染效率。

　　2.3转染前后smad4 mRNA表达的变化  转染细胞HeLa/shRNA2、3与对照细胞HeLa/con相比,smad4 mRNA表达下降,以HeLa/shRNA2明显（P<0.01）, 而实验组HeLa/shRNA1与对照组HeLa/con和HeLa细胞相比无明显差异（P>0.05）,各组间内参照18sRNA表达未见明显差异（P>0.05），见图3。

　　图3real time PCR检测转染后smad4 mRNA2.4smad4 shRNA对HeLa细胞smad4蛋白表达的影响 （略）

　　Western blot结果显示, 五组细胞β?actin表达强度基本一致, 转染细胞HeLa/shRNA2、3 smad4蛋白表达相对于HeLa/con及HeLa两组细胞表达强度减弱，见图4 ,尤以HeLa/shRNA2组明显,而HeLa/shRNA1与对照相比无明显差异，故选择HeLa/shRNA2组进行下一步细胞生物学效应检测。

　　图4Western blot检测细胞转染后smad4蛋白表达（略）

　　3讨论

　　smads 蛋白家族是TGF?β/smads 信号通路中的重要成员,包括smad 1?9 ,都存在于胞质中，将TGF?β/smads 信号转导入核内并参与TGF?β靶基因的调节，根据smads蛋白家族功能将其分为3类:第1类为受体调节型smads (receptor?regulated Smads, R?Smads) ,包括Smad 1～3、5 、8。第2类为通用调节型smads (common?mediator smads, Co?smads)，包括smad4。第3类为抑制型smads (inhibitory smads, Ant?smads), 包括smad 6、7，其作用是抑制TGF?β信号转导。在这些smad分子中，smad4分子在TGF?β信号转导途径中起着关键作用[2]，受体型smads分子接收细胞膜表面的信号后磷酸化，与smad4组成复合物后入核，从而启动一系列基因转录。因此smad4的功能缺失会导致TGF?β通路异常，而TGF?β信号转导异常和肿瘤发生密切相关[3]。Hahn等[4]研究发现，TGF?β信号途径中smad4 蛋白的基因在胰腺癌中总的改变率约为50%，其中纯合性缺失约30%，突变约20%。Yanagisawa在肺癌中也发现了smad4的突变，另外有报道其在头颈部鳞癌，在葡萄膜黑色素瘤[5]也有一定程度的缺失。  

　　宫颈癌(cervical cancer)是最常见的妇女生殖系统肿瘤之一，死亡率位居妇科肿瘤之首，人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染，尤其是高危型HPV 16型感染与宫颈癌的发生密切相关[6]，研究证实90%以上的宫颈癌的发病与人乳头瘤病毒感染有关。Lee 等[7]研究发现，HPV 癌基因E7通过与smad2、3、smad4相互作用阻断了smad的转录活性，并抑制TGF?β活性，从而导致TGF?β通路紊乱而引起肿瘤发生。   
　　为进一步验证smad4对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响，本研究采用了RNA干扰技术特异性阻断smad4的表达。RNA干扰作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，近年来在基因功能研究中得到了广泛的应用,选择恰当的靶基因干涉位点及克隆载体是该技术的关键[8]。我们设计的三段shRNA分别转染细胞，经过稳定筛选，采用RT?PCR技术和western blot验证三段的干扰效率，并从中挑取干扰目标基因效率最高的shRNA2片段进行基因功能研究。本实验中我们选择带有抗药性标志的载体介导shRNA的表达,能够在真核细胞中长时间高效持续抑制目的基因表达,引起基因表达下调。构建的smad4 shRNA真核表达载体使用U6启动子指导shRNA 编码序列的转录,启动子在一个固定距离的位置开始转录合成RNA,它的终止信号为TTTTT,转录产物在第2个T后切开, PolⅢ识别的终止信号终止转录,符合shRNA表达载体的要求,载体上GFP基因更为监测转染效率和稳定筛选和单克隆的挑取提供了可视化的标记。实验结果显示shRNA2获得较高的转染效率和smad4抑制效果。本实验针对smad4的编码区不同部位选取了3条目标序列,抑制smad4表达的能力各不相同,其中shRNA1的抑制效果和对照相比无明显差异，而shRNA2的干扰效率达到70％,这种设计序列差异而导致干扰效率差异推测与目标RNA的空间结构及其与蛋白等高分子间的相互作用有关。

【】
  ［1］Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expre?ssion data using real?time quantitative PCR and the 2–ΔCt method [J]. Methods, 2001，25(4):402?408.

　　[2]Caestecker M P, Piek E, Roberts AB. Role of transforming growth factor?beta signaling in cancer[J]. J Natl Cancer Inst, 2000, 92(17):1388?1402.

　　[3]Kaklamani VG, Pasche B. Role of TGF?beta in cancer and the potential for therapy and prevention [J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2004, 4(4):649 ? 661.

　　[4]Hahn S A, Schutte M, Hoque A T, et al. DPC4 , a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1[J]. Science, 1996, 271(5247):350?353.

　　[5]李鹏程,张虹,丁正平,等.TGF?βR Ⅱ和Smad4 蛋白在葡萄膜黑色素瘤中的表达[J].肿瘤防治杂志，2005,32（1）：35?36.

　　[6]Tan SH, Leong L E, Walker PA, et al. The human papillomavirus type 16 E2 transcription factor binds with low cooperativity to two flanking sites and represses the E6 promoter through displacement of Sp1 and TFIID [J]. J Virol, 1994, 68(10):6411?6420.

　　[7]Lee DK, Kim BC ,Kim IY, et al. The human papilloma virus E7 oncoprotein inhibits transforming growth factor?β signaling by blocking binding of the Smad complex to its target sequence[J] . J Biol Chem, 2002, 277(41):38557?38564.

　　[8]Yu JY, DeRuiter SL, Turner DL. RNA interference by expression of short interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells [J]. PNAS, 2002, 99(9): 6047?6052.