125Ⅰ粒子植入照射对纤维肉瘤S180瘤株的治疗作用及其机制
【摘要】 目的探讨125Ⅰ粒子植入内照射对纤维肉瘤S180瘤株的疗效及其治疗机制。方法本试验选用纤维肉瘤细胞S180株，通过36只雄性昆明种小鼠，建立纤维肉瘤动物模型，随即分成3组：对照组、外放疗组、125Ⅰ粒子内放疗组，每组12只小鼠。外放疗组采用直线加速器照射200 cGy/次，剂量率为210 cGy/分，1次/d，共3次。125Ⅰ粒子内放疗组通过特制长穿刺针将125Ⅰ粒子插入小鼠瘤体内，其中6只小鼠植入1个粒子，另外6只小鼠植入2个粒子。外放疗组照射后6、30、54h取材，内放疗组于粒子植入后4、8d取材，瘤体标本用甲醛固定，用原位末端标记法（TUNEL法）检测凋亡细胞，测定凋亡指数（AI），用免疫组化方法检测p53蛋白。结果(1)对照组未经治疗，也可发生自发性凋亡，但凋亡出现时间较晚，凋亡指数较小。(2)外放疗可以诱导细胞凋亡，且随着时间推移，凋亡指数有所增加。(3)125Ⅰ粒子植入内照射治疗可以诱导S180纤维肉瘤细胞凋亡，凋亡指数达到峰值的时间在4 d左右，且随着植入粒子的增多，照射剂量的增加，细胞凋亡指数也随着增加。2个粒子内照射组与1个粒子内照射组比较，4、8 d P均＜0.05。(4)p53免疫组阴性。结论(1)S180瘤株对放疗敏感性较差，其放疗敏感性与突变型p53状态无关。（2）125Ⅰ粒子植入内照射和外放疗一样，可诱导纤维肉瘤S180瘤株细胞凋亡，而且随着植入粒子的增多，凋亡指数也随之增加，有显著杀伤作用，其诱导细胞凋亡机制与突变性p53基因状态无关。(3)125Ⅰ粒子植入照射是治疗肿瘤的一种有效方法。
【关键词】 125Ⅰ；植入照射；S180瘤标；放疗；凋亡
Therapy Effection and Mechanism of S180 Tumor Cell by 125Ⅰ Seed Implantation
Abstract：ObjectiveTherapy effection and mechanism of S180 tumor cell by 125Ⅰ seed implantation.MethodsThe study use S180 tumor cell,36 male Kunming mice were divided into 3 groups in random,12 mice each group:contrast,radiation and 125Ⅰ seed implantation.Radiation:4?MV X?ray,200 cGy/fraction,three fraction.125Ⅰ seed implantation:insert the seed into the mouse tumor using the special?made needle.One seed was implanted into six mice,two into another six mice.The model mice of radiation were sacrificed at 6h,30h and 54h.The model mice of seed implantation were sacrificed at 4d and 8d.The fresh tumor tissure sample were examined apoptosis by TuNEL,measured the apoptois index (AI) and p53 were measured by immunocytochemistry.Results(1)The contrast group can also have spontaneous apoptosis without treament.But the apoptosis appeared late with lower apoptosis index.(2)Radiation can induce cell apoptosis and the apoptosis index increased with the time went by. (3)125Ⅰ seed implantation can induce S180 cell apoptosis.The peak value within 4d and with the increase of implanted seed,the AI increased.The comparsion between 2 seeds and 1 seed has significant difference within 4d and 8d (P<0.05).(4)p53 count not be found in S180 tumor cell.Conclusion(1) S180 tumor cell are less sensitive to radiation.The radiosensitivity is not realated to mutated?type p53(mtp53).(2)125Ⅰ seed implantation and radiation all can induce S180 tumor cel apoptosis.The induced apoptosis mechanism is not related to mutated?type p53.(3)125Ⅰ seed implantation is effective method in the treament of carcinomas.
Key words：Iodiane?125;Implantation radiation;S180 tumor cell;Radiation;Apoptosis
0引言
125Ⅰ粒子植入治疗肿瘤，属于内照射中近距离放射治疗的内容之一，是一种新的内照射治疗方法[1]。在肿瘤治疗中有非常理想的局部控制率，引起了国内外许多学者的关注。本实验利用S180纤维肉瘤细胞，通过昆明鼠建立纤维肉瘤动物模型，分别采用外照射治疗和125Ⅰ粒子植入内照射治疗进行对比研究，探讨不同时间、不同剂量125Ⅰ粒子内照射的疗效以及从分子和基因水平探讨其治疗机制。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1细胞株鼠纤维肉瘤株（S180株）,由黑龙江省肿瘤研究所提供。
1.1.2动物雄性昆明小鼠，体重18~20g，由黑龙江省肿瘤研究所动物室提供。
1.1.3放射性125Ⅰ粒子源放射活度0.5~0.75mci，直径0.8mm，长度4.5mm，由宁波君安药业科技有限公司提供。
1.1.4主要试剂p53免疫组化试剂盒（一抗：免IgG；二抗：封闭山羊血清），购于博士德生物工程有限公司，原位末端标记法（TUNEL）凋亡检测试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。
1.1.5主要仪器直线加速器ELKTA Pricinel Ⅰ(瑞典)，M?J188型石蜡切片机（HISTKRYOTOM产品），日本Olympus公司普通光学显微镜。
1.2实验方法
1.2.1动物与肿瘤模型制作纯系健康雄性昆明小鼠36只，体重18~20 g，收集S180纤维肉瘤细胞悬液，计数后制成1.5×106个/ml，与每只昆明小鼠右后肢皮下接种0.2ml(3×105个)S180纤维肉瘤细胞，接种后5 d，即可触及皮下肿瘤结节，成功率100%。
1.2.2实验分组待肿瘤长至1cm2时，将36只昆明小鼠随机分成3组：对照组、外照射组、放射性125Ⅰ粒子植入内照射组，每组12只。对照组：饲养环境相同，不给实验处理。外照射组：采用直线加速器，4MV?X，源皮距100cm，小鼠用戊巴比妥纳30 mg/kg麻醉后，将荷瘤小鼠后肢放于照射野内，2Gy/次，剂量率为210 cGy/次，1次/d，共3次。125Ⅰ粒子植入内照射治疗组：125Ⅰ粒子长4.5mm，直径0.8mm，外壳用钛金属封闭，每粒活度为0.5~0.75mci，半衰期为59.6d，能量为27.4~31.5kev，通过专用的特制长穿刺针将125Ⅰ粒子经皮插进小鼠右后肢内，其中6只小鼠各植入1个125Ⅰ粒子，另外6只小鼠各植入2个125Ⅰ粒子。
1.3取材实验处理完毕后，外照射组于照射6、30、50h取材，内照射组于125Ⅰ粒子植后4、8d取材，颈椎脱臼处死小鼠，摘除皮下肿瘤，制备标本。瘤体标本用甲醛固定，用于免疫组化检验p53蛋白和TUNEL法测定凋亡细胞。
1.4末端脱氧核苷酸原位标记法（TUNEL）测定凋亡细胞①检测方法：组织切片常规石蜡脱水；3%双氧水（H2O2），洗3次；蛋白酶K（20μg/ml）溶于Tris/HCL中，pH7.4~8.0，37℃消化后再次洗涤；标本经保湿处理后，每张切片取末端脱氧核糖核酸转移酶和Dig?dUTP各1μl，加入18μl标记缓冲液中混匀，甩去切片上多余液体后，加标记液20μl/片，置样品于湿盒中，37℃标记2h，PBS洗3次；加酶标抗荧光素抗体，37℃、30 min，PBS洗3次；加DAB显色10~30 min，水洗；加苏木精轻度复染；脱水，透明，封片，镜检。②观察标准：光镜下见细胞核内有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，细胞凋亡定量法：每张切片染色后，随机取5个典型的高倍视野（×400），不少于1000个细胞，阳性细胞数以百分数表示，即为凋亡指数（AI）[2]。
1.5免疫组化方法检测p53蛋白正常p53蛋白在细胞中易水解，半衰期为20 min，因而用免疫组织化学方法不能检测到p53蛋白，而突变型p53蛋白构型发生改变，蛋白稳定性增加，导致半衰期延长，可达2~12 h，可通过免疫组化检出，故p53阳性即提示突变型p53基因存在[3]。①检测方法：载玻片防脱片处理；切片常规脱蜡入水；3%双氧水，室温5~10 min，蒸馏水洗3次；将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），微波炉加热至沸腾后，断电间隔5~10 min后，反复1~2次；滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗；滴加适当稀释的一抗（免IgG）4℃过夜，PBS洗3次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，20℃~30℃，20 min，PBS洗3次；滴加试剂SABC，20℃~37℃，20 min，PBS洗5 min4次；DAB显色，镜下见阳性或背景略显黄色，水洗终止；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，镜检。②结果评估：p53蛋白染色阳性细胞为核内染成棕黄色，阴性细胞核为兰色，胞浆不着色。
1.6统计学处理采用SPSS软件包对数据进行处理，数据比较采用t检验。
2结果
2.1外照射与125Ⅰ粒子植入治疗致纤维肉瘤细胞凋亡的变化（TUNEL检测结果）以细胞出现棕黄色颗粒为阳性细胞，每张切片选择5个400倍视野，计数1 000个细胞，阳性细胞以百分数表示，即凋亡指数（AI）。对照组无实验处理时，肿瘤细胞在54 h内没有发生凋亡，而外放疗组肿瘤细胞发生凋亡。随时间推移，凋亡指数在逐渐增加，经t检验，各时间段外放疗组与对照组相比较P＜0.05，故可以为外放疗组与对照组凋亡指数不同，差异有统计学意义，见表1。
表1外放疗组与对照组细胞凋亡指数对比（略）
与对照组比较P＜0.05
对照组虽未经实验处理，但肿瘤细胞也可发生凋亡，第4d与第8d凋亡指数比较P>0.05无统计学意义。1个粒子内照射组第4d时凋亡指数较高，而第8d时凋亡指数反而所下降，两者比较P<0.05，差异有统计学意义，1个粒子内照射组第4d取材时凋亡指数与对照组第4d时比较，P<0.05差异有统计学意义，而第8d时凋亡指数与对照组第8d时凋亡指数的差异无统计学意义。2个粒子内照射组凋亡指数同样在第4d时最高，在第8d时反而有所下降，两者比较P<0.05，有统计学意义。且与1个粒子内照组比较，第4、8d P值均<0.05，差异有统计学意义。说明随着照射剂量增加，凋亡指数也相应增加，见表2。
表2125Ⅰ粒子植入内照射组与对照组细胞凋亡指数（±s）对比（略）
注：P值为同一组中第4d与第8d取材细胞凋亡指数的比较，括号内为t值。*与对照组比较P＜0.05(t=6.39);**2个粒子内照射组与1个粒子内照射组比较，第4d时P＜0.05(t=5.98)，第8d时P＜0.05(t=6.18)
2.2p53蛋白各组（对照组、外放疗组及125Ⅰ粒子内照射组）不同取材时间，p53蛋白始终为阴性，未检出p53蛋白染色阳性细胞。
3讨论
本实验目的是探讨125Ⅰ粒子植入治疗肿瘤疗效以及从分子和基因水平探讨其治疗机制。临床上应用放疗的作用机制之一就是诱导敏感细胞发生凋亡，所以检测凋亡是疗效评价的一个指标。采用TUNEL检测法。本实验外照射剂量共6Gy，外照射剂量率比较高，为210cGy，照射后很快即可诱导肿瘤细胞发生凋亡，故外照射6 h后即可取材，而125Ⅰ粒子植入内照射剂量率低，125Ⅰ粒子初始剂量率仅为7.7 cGy/h，需要长时间持续照射才能起到杀伤肿瘤细胞的作用。理论上，125Ⅰ粒子植入肿瘤内第4d时，其释放的剂量与外照射的剂量6Gy相近，故本实验内照射取材时间选在第4d。从本实验得出：（1）对照组肿瘤细胞即使不经治疗也可以发生自发性凋亡，与[4]一致，但凋亡出现时间较外放疗和内放疗晚，而且凋亡指数较小。有学者认为，放疗反应与凋亡本底水平具有相关性，因此，治疗前通过组织活检，检测凋亡水平，一般认为，具有较高凋亡水平的肿瘤要比具有较低凋亡水平的肿瘤对放疗敏感。本实验中可以看到，小鼠纤维肉瘤细胞自发性凋亡水平较低，故可推测，小鼠纤维肉瘤细胞对放疗敏感性较差。(2)外照射治疗可以诱导纤维肉瘤细胞凋亡，在照射后6h即可发生凋亡，凋亡出现较早，随着时间推移，细胞凋亡指数有所增加。(3)125Ⅰ粒子植入内照射治疗可以诱导纤维肉瘤细胞发生凋亡。125Ⅰ粒子植入治疗是指通过一定方法将封装好的具有一定规格、活度的微型放射源125Ⅰ引入体内肿瘤靶区，通过其衰变释放出γ射线杀伤肿瘤细胞，125Ⅰ粒子半衰期较长，能量较低，在组织中有足够的穿透力，易制成微粒源等特点，适于生长缓慢肿物的永久植入治疗[5]，本实验将125Ⅰ粒子直接用特制长穿刺针插进小鼠瘤体内进行内放射治疗。表2中显示，1个粒子内照射组，在植入第4d时凋亡指数较高，明显高于对照组（P＜0.05），而第8d时，凋亡指数反而有所下降。有文献报道[6,7]，放射诱导的凋亡指数达到峰值的时间因细胞系类型不同而不同，与受照射剂量无关，故可认为小鼠纤维肉瘤细胞凋亡指数达峰值时间在4d左右。2个粒子内照射组，凋亡指数同样在第4d时最高，第8d时有所下降，与1个粒子内照射组比较，4、8d时P均＜0.05，说明随着植入粒子数增多，照射剂量的增加，小鼠纤维肉瘤细胞的凋亡指数也随之增加，但凋亡指数达峰值的时间没有随照射剂量增加而改变，且随着粒子数增多，照射剂量增多，凋亡指数也随之增加，疗效显著。（4）p53基因有野生型和突变性之分，野生型p53半衰期仅6~20 min，而突变型p53半衰期长达数小时，突变p53具有癌蛋白活性，且稳定性增高，通过免疫组化检出。p53基因对细胞凋亡有调控作用，野生型p53基因编码的p53蛋白对细胞凋亡有促进作用，而突变型p53基因编码的p53蛋白对细胞凋亡有抑制作用[8]。p53与肿瘤放射敏感性有关，野生型p53对食管癌、鼻咽癌有放射增敏效果，而突变型p53与放射抗拒有关。因此，肿瘤中p53的状态只能代表某些肿瘤的放射敏感性[9,10]。在本实验中，p53的表达均为阴性，说明突变的p53未参与细胞凋亡的调控，S180的放射敏感性与突变型p53的状态无关。综上表明，125Ⅰ粒子植入内照射可以诱导纤维肉瘤S180瘤株细胞凋亡，是其治疗肿瘤的机制之一，其诱导细胞凋亡的机制与突变型p53基因状态无关，适用于多种肿瘤，加之可以使肿瘤靶区高剂量，而周围正常组织损伤小，按病灶形态植入，持续性照射治疗，创伤小，不会产生放射泄露，操作简便等特点，使其临床应用显示了广阔的前景。
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