辛伐他汀对PTHrP诱导的破骨细胞性骨吸收及小鼠颅盖骨代谢的影响
作者：黄鲁豫，胡蕴玉，陶惠人，毕龙
【关键词】 辛伐他汀
摘 要：［目的］探讨辛伐他汀对体外甲状旁腺素相关肽（PTHrP）诱导小鼠的破骨细胞骨吸收功能的作用及其小鼠骨代谢的影响。［方法］采用PTHrP诱导小鼠骨髓细胞培养破骨细胞和小鼠颅盖骨培养体系，检测辛伐他汀作用8 d后破骨细胞骨吸收陷窝和培养上清钙的变化；检测小鼠颅盖骨培养上清碱性磷酸酶和钙含量，组织学观察小鼠颅盖骨形态学变化。［结果］辛伐他汀体外可明显抑制PTHrP诱导小鼠的破骨细胞骨吸收陷窝的形成及培养上清钙的释放，辛伐他汀体外可增强小鼠颅盖骨培养上清碱性磷酸酶的活性，组织学观察到辛伐他汀使小鼠颅盖骨矿化增强。［结论］辛伐他汀体外不仅可促进小鼠颅盖骨的成骨活性，并且可明显抑制PTHrP诱导小鼠的破骨细胞骨吸收功能，对骨吸收性疾病有着重要的防治作用。
关键词：辛伐他汀; 破骨细胞; 骨吸收; 甲状旁腺素相关肽（PTHrP）
Abstract：［Objective］To study the effect of simvastatin in the osteoclastic resorption stimulated by PTHrP and murine bone anabolism in vitro［Method］The bone resorption activities of the osteoclast stimulated by PTHrP were evaluated after treatment with simvastatin for 8 days in vitro;the concentration of Ca2+ in the supernatant was also detected by atomic absorption spectrometerThe concentration of ALP and Ca2+ of the supematant in murine calvarial organ culture were detectedThe histology of calvaria was observed［Result］Simvastatin greatly inhibited the osteoclastic bone resorption stimulated by PTHrP in vitro and reduced the release of Ca2+Simvastatin increased the ALP activities and bone mineralization of murines calvarial organ culture in vitro［Conclusion］Simvastatin may inhibit the osteoclasric resorption stimulated by PTHrP and promote osteoblast differentiation and bone mineralization in vitro,thus play an important role in the prevention and treatment of osteoporosis
Key words：Simvastatin; Osteoclast; Bone resorption; PTHrP
他汀类药物由于抑制了胆固醇代谢中甲羟戊酸途径的HMGCoA（3Hydroxy3MethylglutarylCoenzyme A）还原酶活性，具有明显的降血脂作用，目前是一种广泛用于临床的降脂药。1999年Mundy等〔1〕在筛选了3万多种化合物后发现，他汀类药物是唯一能促进成骨细胞BMP2荧光报告基因活性的物质。进一步的研究表明他汀类药物可促进成骨细胞系MC3T3E1及大鼠骨髓细胞的碱性磷酸酶活性和骨质的矿化〔2、3〕，并且可促进骨质疏松大鼠新生骨的形成〔4〕。在正常生理条件下骨吸收与骨形成处于动态平衡状态中，一旦这种平衡被打破将可能会导致骨质疏松的发生。破骨细胞是骨吸收的功能细胞，其吸收功能的亢进与活跃在骨质疏松中具有重要的意义。尽管以往有研究表明，他汀类药物可能通过促进成骨细胞BMP2基因的表达来促进骨生成，但其对正常成熟破骨细胞的骨吸收功能影响尚未见有报道。本研究采用体外PTHrP诱导骨髓细胞形成破骨细胞的培养体系，以及小鼠颅盖骨骨培养，探讨辛伐他汀对破骨细胞性骨吸收及其小鼠骨代谢的影响，为阐明他汀类药物对骨质疏松的防治作用提供新的理论依据。
1 材料和方法
11 主要试剂和动物
辛伐他汀原料药（simvastatin），由山东鲁南制药集团提供（生产批号：050502）。甲状旁腺素相关肽（PTHrP）：美国Cytolab公司；αMEM培养基，美国Gibco公司；胎牛血清（FCS），Hycolon公司；抗酒石炭酸染色试剂盒，日本Hokudo株式会社。BalB／C小鼠（清洁级）：由第四军医大学动物实验中心提供。
12 方 法
121 骨薄片的制作
新鲜牛股骨干皮质骨25％戊二醛固定，以低速锯式切片机横切，手锯修成1 cm×1 cm×1 cm大小，leica硬组织切片机切成30 μm厚度的薄片，100目木砂纸上打磨，梯度酒精脱水，稀氨水超声波清洗10 min×3次，钴60照射消毒。
122 破骨细胞分离及培养
出生4～6周雄性的Balb／C小鼠，脱颈处死后，750 ml／L乙醇浸泡5 min。取双侧股骨和胫骨，清除软组织和两端骨骺，用不含血清的αMEM培养液冲洗髓腔，收集骨髓细胞并用培养液洗涤两次，然后将细胞重悬浮于含100 ml／L胎牛血清的αMEM培养液中，细胞计数后，配成15×109 L-1的细胞悬液，24孔细胞培养板，每孔2 ml，在50 ml／L CO2的37 ℃孵箱中培养。每2 d更换1次培养液，每次换液时，移去1ml旧的培养液，补充等量新的培养液。培养6~8 d。
123 辛伐他汀的添加
共分4组：阳性对照组，在换培养液时每培养孔中加入45 ng／ml PTHrP：实验组每培养孔在换培养液时加入45 ng／ml PTHrP和分别加入10-5、10-6、10-7 mol／L辛伐他汀，每组2孔，分别有1孔放有骨磨片1个。
124 抗酒石酸染色
染色时，培养板中贴壁的细胞进行抗酒石酸染色（TRAP染色），培养6 d后，小心移去培养液，用磷酸缓冲液（PBS）洗涤后，按说明书操作，首先用乙醇-丙酮（1∶1）混合液固定5 min后，去离子水洗涤3次，然后加入底物和染色质的混合液，37 ℃孵箱中温育20～60 min，见染色良好后，移去反应液，去离子水洗涤以终止反应，室温过夜干燥。
125 破骨细胞计数
倒置显微镜下，所有3个或3个以上细胞核的抗酒石酸染色阳性的巨大细胞均为破骨细胞。其他细胞，如巨噬细胞、成骨细胞、成纤维细胞抗酒石酸染色均为阴性。实验重复5次，结果表示为均数±标准差。
126 破骨细胞吸收功能的测定
培养6 d后，取出骨磨片，去离子水冲洗3遍，甲醛固定液固定，甲苯胺蓝染色，并用扫描电镜观察，骨磨片的吸收陷窝。
127 原子分光光度计测钙
在培养7 d取培养液上清，采用PE 3060原子吸收光谱仪测钙含量；条件为：波长3224 nm，灯电流75 mA，光谱宽度26 nm，空气压力16×105 Pa，乙炔气压力03×105 Pa。
13 辛伐他汀对小鼠颅盖骨骨代谢的影响
131 BalB／C小鼠颅盖骨的分离和培养
出生1周的Ba1B／C小鼠用700 ml／L乙醇浸泡5 min，PBS液洗去乙醇，无菌剪开头皮，取颅骨，去净颅骨内外表面的骨膜及软组织，沿冠状缝和人字缝剪开，完整分离左右顶骨，置入含有100 ml／L胎牛血清的αMEM培养液中，预培养24 h后将颅盖骨置入24孔培养板孔内；每孔加入2 ml重悬浮于含100 ml／L胎牛血清的αMEM培养液中，细胞计数后，配成15×109 L-1的骨髓细胞悬液；共分4组：阳性对照组。在换培养液时每培养孔中加入45 ng／ml PTHrP，实验组每培养孔在换培养液时加入45 ng／ml PTHrP和分别加入10-5、10-6、10-7 mol／L辛伐他汀。
132 培养上清原子能分光光度计测钙
小鼠颅盖骨体外培养8 d取上清，测定上清液中钙的含量，方法同上。
133 培养液上清测定碱性磷酸酶活性
小鼠颅盖骨体外培养8 d取上清，用碱性磷酸酶检测试剂盒在日立7170全自动生化分析仪上检测碱性磷酸酶活性。
134 石蜡切片的制备及组织学观察
取培养8 d的颅盖骨，固定液固定，石蜡包埋，切片厚5 μm，HE染色，在Leico LA（德国）全自动显微镜和Pixaev数码采集系统组成的图像分析仪系统下采集图像，分析骨面积（图1）。
14 统计学处理
所有数据采用SPSS 100统计软件包处理，进行t检验。
2 结 果
21 辛伐他汀对PTHrP诱导的破骨细胞形成和功能的影响
211 辛伐他汀对PTHrP诱导的破骨细胞形成的作用
5次试验所得结果显示，01 μmol/L的辛伐他汀明显抑制破骨细胞的形成，1 μmol/L浓度下，几乎完全抑制PTHrP诱导的破骨细胞形成（表1、图1）。表1 辛伐他汀对PTHrP诱导的破骨细胞形成的影响骨磨片在对照组和辛伐他汀10-5、10-6mol/L组均无明显的吸收陷窝形成，只有在辛伐他汀0、10-7mol/L两组有吸收陷窝的形成，并且在无辛伐他汀组的吸收陷窝形成较多（图2~4）。
213 培养上清测钙的结果
PTHrP诱导的破骨细胞6 d，上清钙含量提示，在辛伐他汀浓度为10-5、10-6、10-7 mol／L时，用药组明显少于对照组，差异具有统计学意义，随着药物浓度的增加钙含量降低（表2）。表2 辛伐他汀对体外PTHrP诱导的破骨细胞培养液上清钙含量的影响
221 培养上清碱性磷酸酶和Ca2+含量测定结果
测定小鼠颅盖骨体外培养第8 d上清液中ALP的活性，提示用辛伐他汀组在浓度10-5、10-6mol/L时上清中ALP的活性明显升高，与对照组比较具有统计学意义，辛伐他汀在10-7mol/L时ALP的活性与对照组比较差异则无统计学意义;原字分光光度计测定Ca2+含量，用辛伐他汀各组与对照组比较均无统计学差异（表3）。表3 辛伐他汀体外对小鼠颅盖骨培养液上清中Ca+和ALP的影响
22 组织学观察
小鼠颅盖骨培养8 d，可见对照组骨组织吸收明显，用Simvastatin组，Simvastatin浓度在10-5、10-6、10-7 mol／L时，可见骨质吸收明显减轻，骨质较致密（图5、6）。 图1在PTHrP的刺激下，培养骨髓细胞6 d，大量破骨细胞生成（TRAP ×200） 图2在PTHrP的刺激下，培养骨髓细胞8 d，骨膜片形成的吸收陷窝（甲苯胺兰染色 ×200），蓝色为形成的吸收陷窝 图3在PTHrP的刺激下，加入10-7mol/L的辛伐他汀，扫描电镜照片见吸收陷窝明显减少 图4在PTHrP的刺激下，加入10-6mol/L的辛伐他汀，扫描电镜照片无吸收陷窝 图5体外培养第8 d，对照组小鼠颅盖骨骨质吸收明显（HE×100） 图6体外培养第8 d，辛伐他汀10-7 mol/L组，小鼠颅盖骨较对组照骨质增厚明显（HE×200）
3 讨 论
骨转移癌引起的高血钙症（humoral hypercalcemia of malignancy,HHM）与甲状旁腺功能亢进引起的高血钙症在临床症状上相似〔4〕。在不同的癌组织都纯化出了甲状旁腺素相关蛋白（parathyroid hormonerelated protein，PTHrP），被认为是介导HHM的主要因子〔5〕，PTHrP具有诱导破骨细胞形成的能力，从而导致骨吸收破坏，造成HHM。陶惠人和许多荣等〔6、7〕又成功地建立了PTHrP诱导小鼠全脊髓细胞形成破骨细胞的培养体系。使破骨细胞的体外形态功能及调控研究成为可能。它排除了体内复杂因素的干扰，研究单一因素对破骨细胞的作用，体外将破骨细胞与骨片共培养可反映破骨细胞的骨吸收能力，尤其是研究药物对破骨细胞骨吸收的影响，但此方法的缺点在于不能反映出体内骨吸收复杂的调控关系，颅盖骨保持了原有骨组织细胞的结构及其相互关系，具有相对完整性，有利于观察培养体系中各细胞之间的正常关系、相互影响以及局部环境的调节作用，是研究骨组织代谢的理想模型。
在破骨细胞吸收的过程中，破骨细胞首先与骨片紧密结合，然后细胞极化形成骨吸收器官，由细胞内的Ⅱ型碳酸酐酶（CAll）将CO2和H2O生成H2CO3，H2CO3分解为H+和CO3-，皱褶缘处的空泡型质子泵（VATPase）将H+分泌到骨吸收的微环境中使骨脱钙；破骨细胞吸收骨为游走性的，在一区域吸收结束后可游走到其它区域进行骨吸收，从而在骨片上形成一团团吸收陷窝。因此骨吸收陷窝和游离到培养上清中的钙是反映破骨细胞骨吸收能力的的可靠指标。本研究结果表明，辛伐他汀在浓度10-5、10-6、10-7 mol／L时均使破骨细胞骨吸收陷窝数目明显减少，辛伐他汀在浓度10-5、10-6、10-7 mol／L时均使破骨细胞骨形成数目，明显减少，培养上清中钙含量也明显减少，且呈量效关系，提示辛伐他汀体外可直接抑制破骨细胞的形成及其骨吸收功能。
碱性磷酸酶（ALP）是成骨细胞的特异性标志，ALP含量的高低与成骨细胞的分化密切相关。小鼠颅盖骨体外培养第8 d，浓度为10-5、10-6mol/L辛伐他汀培养上清液中ALP的活性明显增强，组织学观察也明显提示辛伐他汀在浓度10-5、10-6、10-7mol/L时小鼠头盖骨明显比对照组骨质吸收减轻，骨质较致密，矿化增强。这说明辛伐他汀体外既能抑制破骨细胞的骨吸收又能促进成骨细胞的分化和功能，本实验中用辛伐他汀各组培养小鼠颅盖骨的上清中钙含量与对照组比较均无统计学差异；可能是由于颅盖骨培养体系反映的是一个整体效应，不只单纯反映破骨细胞的功能状态，所以不如单纯成熟破骨细胞培养体系那么敏感所致。但从实验结果可以可看出，用辛伐他汀各组在浓度10-5、10-6、10-7mol/L时培养液上清中钙含量有下降趋势，提示在颅盖骨培养体系中辛伐他汀可抑制破骨细胞骨吸收活性。
治疗骨质疏松的药物二磷酸盐，由于抑制甲羟戊酸代谢途径下游产物的生成，是GPT蛋白ras，rho家族活化受阻而具有明显的抑制破骨细胞功能的作用〔8〕。在甲羟戊酸代谢途径中他汀类药物作为上游途径中HMGCoA还原酶抑制剂，必将影响其下游产物的生成。因此他汀类药物在促进成骨细胞活性的同时，可能对破骨细胞也有抑制作用。Grasser WA〔9〕等研究表明洛伐他汀对体外培养新生大鼠破骨细胞的形成和分化有着明显的抑制作用，通过对甲二羟戊酸在破骨细胞发育代谢中作用的研究证实龙牛儿基龙牛儿醇在破骨细胞的形成和分化中起着重要的作用，洛伐他汀对破骨细胞的抑制作用是通过关键异戊烯化蛋白的二牛龙牛儿基丙酮完成的，并且他汀类药物的骨效应是影响局部破骨细胞的数量。Von knoch F等〔10〕人在2005年报告了大鼠口服120 mgkg-1d-1洛伐他汀可以抑制超高分子量的聚乙烯（UHMWPE）颗粒诱导的大鼠颅骨的骨吸收，并使局部破骨细胞数目减少。黄鲁豫〔11〕等报道辛伐他汀在皮下注射10 mg・kg-1・d-1可抑制小鼠头盖骨的骨吸收和破骨细胞的形成。这些观点和本实验的结论是一致的。
本研究采用PTHrP诱导的破骨细胞培养体系和小鼠颅盖骨培养观察到，辛伐他汀在体外不仅可促进成骨细胞ALP的表达，同时还可以直接抑制PTHrP诱导的破骨细胞的形成和功能，对骨吸收性疾病的防治具有重要意义。
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