骨肉瘤中P

          作者：戴闽，聂涛，万细珍，罗志平，宗世璋

【关键词】  骨肉瘤

　　摘  要：［目的］探讨P糖蛋白、Survivin在骨肉瘤中的表达情况与化疗疗效的关系。［方法］对38例骨肉瘤术前的活检标本用免疫组织化学方法分别检测P糖蛋白、Survivin的表达。［结果］P糖蛋白阳性组化疗有效率低于P糖蛋白阴性组；Survivin过表达组化疗有效率明显低于Survivin弱表达组。经Logistic回归分析，Survivin对化疗疗效的预测价值更大。［结论］骨肉瘤中P糖蛋白、Survivin的表达情况对化疗疗效均有一定的预测价值，其中Survivin更大。

    关键词：骨肉瘤；  P糖蛋白；  Survivin；  免疫组织化学

      Abstract：［Objective］To explore the relationship between Pglycoprotein,survivin expression and chemotherapy outcome［Method］The expressions of Pglycoprotein,and of survivin were examined by the immunohistochemistry in 38 specimens of preoperation biopsy of osteosarecomas［Result］The response rate of the Pglycoprotein positive group was lower than that of Pglycoprotein negative groupThe response rate of the survivin overexpression group was significant lower than survivin was found to be more valuable in predicting chemotherapy results［Conclusion］The expressions of Pglycoprotein,and of survivin are clearly associated with osteosarcomas response to chemotherapy in osteosarecoma and survivin is a more valuable parameter

    Key words：Osteosarcoma;  Pglycoprotein;  Survivin;  Immunohistochemistry

    骨肉瘤是好发于青少年的恶性骨肿瘤，预后很差。自1982年Rosen提出“新辅助化疗”的概念后，骨肉瘤的取得了突破性的进展，5 a无瘤生存率由原来单纯手术的20%提高到80%。因此，化疗的疗效是决定患者预后的主要因素。尽管化疗的研究已取得很大进展，但临床上仍有一定比例的患者因对化疗有原发性或继发性耐药而导致化疗失败。因而，如何使骨肉瘤化疗更具有针对性、有效性，对化疗敏感性预测的研究显得至关重要。本研究旨在采用免疫组织化学技术，研究骨肉瘤中P糖蛋白、Survivin的表达情况与化疗疗效的关系，以探讨这些指标在预测骨肉瘤化疗疗效方面的临床应用价值。

    1  材料与方法

    11  临床资料

    收集本院1999~2004年骨肉瘤患者38例，均为首次接受抗肿瘤治疗者，并经切开活检病理切片证实为骨肉瘤，其中男23例，女15例；年龄最大的为66岁，最小的为10岁，平均为257岁。按Enneking外科分期：Ⅰ期4例，ⅡA期9例，ⅡB期20例，Ⅲ期5例。手术方式和化疗方案：所有患者术前均行区域阻断性动脉灌注化疗3~4次，化疗药物为顺铂，以80 mg/m2剂量。然后手术治疗，21例行肿瘤型假体关节置换术，4例采用瘤段灭活再植术，4例行异体半关节移植，9例行截肢术，术后采用大剂量氨甲喋呤（HDMTX）、阿霉素（ADR）、顺铂（DDP）、异环磷酰胺（IPO）组成化疗方案。以上病例均获随访，随访时间为1~4 a。

    12  方  法

    采用免疫组织化学SP法进行P糖蛋白、Survivin表达的检测，所有试剂均购置于福州迈新公司。石蜡切片常规处理后，置001mmol/L、pH 60枸橼酸盐缓冲液中经微波修复抗原。实验步骤严格按试剂盒说明书操作。以已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。DAB显色，苏木素复染、封片、镜检。

    13  结果判定

    P糖蛋白阳性表达位于细胞胞浆和细胞膜，Survivin阳性结果主要位于细胞胞浆内，两者均以出现棕黄色细颗粒为阳性。在400倍光镜下至少观察5个视野，肿瘤阳性细胞＞5%为阳性表达，≤5%为阴性表达。Survivin按阳性细胞所占百分比分为44级：“-”表示无阳性细胞，“+”表示阳性细胞≥5%，“++”表示阳性细胞数在25%~50%之间，“+++”表示阳性细胞数≥50%，其中“+”和“++”为弱表达，“+++”为过表达。

    14  统计学处理

    采用Fishers精确概率法及Logistic回归分析进行统计学处理。

    2  结  果

    21  骨肉瘤中P糖蛋白、Survivin的表达与化疗疗效的相关性

    38例骨肉瘤患者中P糖蛋白的阳性表达率为4736%，Survivin阳性表达率为6315%。其中Survivin弱表达率为625%，过表达率为375%。P糖蛋白阳性表达组18例，化疗有效率为3028%；P糖蛋白阴性表达组20例，化疗有效率为6437%，两组比较有显著性差异（P＜005）。Survivin过表达组9例，化疗有效率为304%；Survivin弱表达组15例，化疗有效率为728%，两组比较有显著性差异（P＜005）（表1）。 表1P糖蛋白、Survivin的表达情况与化疗疗效的关系把P糖蛋白、Survivin作为自变量，化疗疗效作为应变量，量化后进行Logistic全因素分析（表2）。从全因素Logistic回归模型上看P糖蛋白（X1）,Survivin（X2）对化疗结果的影响有显著性，且Survivin指标的预测价值更大（表3）。 表2  Logistic回归各因素量化表

　　3  讨  论

    31  预测骨肉瘤化疗疗效的意义

    化学是肿瘤综合治疗的重要组成部分，也是治愈某些肿瘤的唯一方法，但由于化疗药物本身具有细胞毒性，而肿瘤存在对化疗药物的不敏感性，致使某些肿瘤病人在接受化疗后可能出现肿瘤没有得到有效控制，反而产生不良反应，影响病人生活质量。有时即使根据肿瘤类型选择了相应的经典化疗方案，但由于肿瘤的异质性也无法预测化疗疗效，使治疗存在盲目性。目前，评价骨肉瘤化疗疗效的方法较多，但由于各种方法都有其不足之处，如检测肿瘤坏死率操作烦琐，费时费力；磁共振血管造影术费用高，较易导致假阳性等。因而有必要探索一种既准确又简便的评价方法来预测化疗疗效，以指导临床选择化疗药物和化疗方案，提高化疗疗效。

    32  P糖蛋白表达与化疗疗效的关系

    肿瘤多药耐药是进一步提高骨肉瘤化疗疗效的主要障碍之一。近来多方面的研究表明，mdr1基因的过表达是导致肿瘤细胞产生多药耐药的主要机制，Pgp为其编码的蛋白质，由1 280个氨基酸组成，相对分子质量为170×103，耐药作用机制为细胞膜上Pgp分子形成ATP依赖性膜泵结构，当抗癌药物进入细胞内时，通过ATP水解能把药物泵出细胞外，使细胞内药物浓度下降，从而产生耐药性〔1〕。有报道〔2〕，Pgp表达的检测比mdr1基因的检测更能直接反映多药耐药现象。Baldini等〔3〕对37个未发生转移的骨肉瘤患者肿瘤切片做了免疫组织化学染色，对其中P糖蛋白表达与患者生存率的关系进行分析，发现P糖蛋白的广泛表达与高的全身复发率显著相关，因此认为，P糖蛋白的表达可作为预后不良的一个可靠指标。近来Serra等〔4〕研究认为，P糖蛋白阳性表达水平的增高为骨肉瘤复发的高危因素。国内于秀淳等〔5〕研究发现，骨肉瘤化疗前后P170阳性表达率有明显差异，并认为通过检测外周血淋巴细胞P170蛋白可以评价化疗疗效。本研究发现，P糖蛋白阳性表达的患者，同一方案化疗有效率低于阴性组。进一步提示，骨肉瘤患者中P糖蛋白阳性表达者化疗效果差，因而认为，P糖蛋白对化疗效果的预测有助于选择最佳治疗方案。

    33  Survivin表达与化疗疗效的关系

    目前研究表明〔6〕，肿瘤化疗的作用机制之一是诱导肿瘤细胞凋亡。因此，调控肿瘤细胞凋亡基因的改变必然对化疗的效果产生影响。Bcl2基因是迄今研究得最深入、最广泛的凋亡调控基因之一，它通过广泛抑制各种刺激因素，抑制细胞凋亡、延长细胞活力而发挥生物学作用。Beale等〔7〕研究认为，Bcl2表达与化疗疗效有相关性，可预测新辅助化疗的长期疗效。Survivin是新近发现的一种凋亡抑制蛋白，表达于胚胎发育组织和人类大多数肿瘤，而在正常成熟组织中不表达，其抑制细胞凋亡的作用远大于Bcl2家族，被认为是迄今发现的最强的凋亡抑制因子。Sarela等〔8〕研究证实，Survivin能降低胰腺癌细胞对放、化疗的敏感性。Kato等〔9〕曾检测14例术前化疗的食管癌组织，发现缓解组的Survivin阳性率明显低于疾病稳定或进展组。本实验研究结果显示，Survivin过表达组化疗有效率为304%，与Survivin弱表达组化疗有效率728%比较有显著性差异。因此，Survivin作为预测骨肉瘤化疗敏感性及预后的新指标，有其临床应用价值。

    文献：

    〔1〕  Labialle S,Gayet L,Marthinet E,et al.Transcriptional regulators of the human multidrug resistance 1 gene:recent views［J］.Biochem Pharmacol,2002，64（5）:938943.

    〔2〕  Hegewisch-Becker S,Hossfeld DK.The MDR Phenotype in hematolotic malignancies:prognostic relevance and future perspectives［J］.Ann Hematol,1996，72:105117.

    〔3〕  Baldini N,Scotlandi K,Serra M,et al.Pglycoprotein expression in osteosarcoma:basis for riskadapted adjuvant chemotherapy［J］.J Orthop Res,1999，17（5）:629632.

    〔4〕  Serra M,Scotlandi K,ReverterBranchat G,et al.Value of Pglycoprotein and clinicopathologic factors as the basis for new treatment strategies in highgrade osteosarcoma of the extremities［J］.J Chin Oncol,2003，21（3）:536542.

    〔5〕  于秀淳，刘晓平，周银，等.化疗对骨肉瘤患者淋巴细胞P170蛋白表达的影响及意义［J］.矫形外科杂志,2004，12（9）:707709.

    〔6〕  Gorezyca W,Gong J,Ardelt B,et al.The cell cycle related differences in susceptibility of HL60 cell to apotosis induced by various antitumor agents［J］.Cancer Res,1993，53（13）:31863192.

    〔7〕  Beale PJ,Rogers P,Boxall F,et al.Bce2 family protein expression and platinum drug resistance in ovarian carcinoma［J］.Br J Cancer,2000，82（2）:436440.

    〔8〕  Sarela AI,Verbeke CS,Ramasdale J,et al.Expression of survivin:a novel inhibitor of apoptosis and cell cycle regulatory protein,in pancreatic adenocarcinoma［J］.Br J Cancer,2002，86:886892.

    〔9〕  Kato J,Kuwabara Y,Mitani M,et al.Expression of survivin in esophageal cancer:correlation with the prognosis and response to chemotherapy［J］.Int J Cancer,2001，95（2）:92.