Stat3靶向RNA干扰重组体的构建及鉴定

           作者：吕伟 张超 郝迎学 刘伟 余佩武

【摘要】  目的 设计针对Stat3的发夹样RNA干扰重组体，通过脂质体转染结肠癌细胞HCT116观察其干扰效果，为探索肿瘤基因的新途径奠定基础。方法 设计针对Stat3编码区的有短发夹结构的两条DNA序列，经退火成互补双链，克隆到载体Pavu6＋27中构建重组体Pavu6＋27?Stat3，再对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析。脂质体法转染重组体至大肠癌HCT116细胞株中，以空质粒(Pavu6＋27)转染为对照；RT?PCR法观察Stat3基因表达改变。结果 酶切鉴定和测序分析均提示Stat3靶向RNA干扰重组体的构建成功，Pavu6＋27?Stat3转染后HCT116细胞Stat3基因表达较空载体Pavu6＋27转染的对照组显著下降。结论 Stat3靶向RNA干扰重组体成功构建，并能有效抑制HCT116细胞中Stat3基因表达。本实验为下一步利用RNAi技术沉默肿瘤细胞中Stat3基因的表达，诱导肿瘤细胞凋亡或抑制其增生，为探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础。

【关键词】  Stat3 RNA干扰 HCT116细胞系

    【Abstract】  Objective  To construct RNA interference expression vector of targeting Stat3 and test the silencing effect by using liposome transfecting colon cancer cell line HCT116 to make foundation for exploring new way of gene therapy for cancer. Methods  Two DNA sequences containing small hairpin structure were designed and synthesized. The complement form obtained by annealing was inserted into vector Pavu6＋27 to construct the recombinant Pavu6＋27?Stat3, the plasmid of which was then identified by enzyme digestion and DNA sequence analysis. The recombinant plasmid was transfected into human colon cancer cell line HCT116 by DOTAP method to assay the suppression effect of Stat3 by RT?PCR 48 hours after transfection. Empty plasmid (Pavu6＋27) transfected into the same cell line was set as control group. Results  The enzyme digestion analysis and DNA sequencing showed that RNA interference expression vector of targeting Stat3 was constructed successfully. The expression of Stat3?mRNA in HCT116 cell line transfected with Pavu6＋27?Stat3 was weaker than that transfected with Pavu6＋27. Conclusions  RNA interference expression vector of targeting Stat3 is successfully constructed and can effectively inhibit expression of Stat3 in colon cancer cell line HCT116. Our study makes a foundation for gene therapy for cancer by using RNAi technique to silence expression of gene Stat3 in cancer cells and induce apoptosis or inhibit proliferation of cancer cells.

    【Key words】  Stat3; RNA interfering; HCT116 cell line

    Stat3是信号传导及转录活化因子家族(signal transducers and activators of transcription,Stats)的重要成员。研究表明Stat3可通过抑制凋亡或诱导细胞增生参与肿瘤的发生和，在癌细胞中有高度的活性［1］。Stat3能编码凋亡抑制剂和细胞周期调节剂， 通过上调Bcl?Xl、 Mcl?1、 cyclins D1/D2和c?myc基因的作用参与肿瘤的形成［2］。有研究显示，Stat3异常激活与乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关［3-4］。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由双链RNA(double strande dRNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制，RNAi能够高效特异地沉默同源基因的表达。1998年RNAi的发现［5］，特别是在哺乳动物细胞应用小干扰RNA(small interfering，siRNA)成功介导RNAi［6］，为基因功能的研究提供了强大的武器，也为肿瘤基因治疗增添了新的活力。本实验拟构建以Stat3基因为靶向的RNA干扰重组体，通过RNAi技术沉默Stat3基因的表达来探索肿瘤基因治疗的新方法。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    真核表达载体为质粒Pavu6＋27(由美国Michigan大学生物化学系David Engelke博士惠赠)，克隆用大肠杆菌JM109(由第三军医大学中心实验室保存),HCT116细胞株购自医学院基础医学研究所细胞中心。限制性内切酶SalⅠ、Hind Ⅲ、 XbaⅠ、 Bam HⅠ， T4 DNA连接酶，RT?PCR试剂盒均为大连TaKara生物公司产品；电泳Mark选用DL2000核酸分子量标准、柱离心式质粒抽提试剂盒、柱离心式胶回收试剂盒均购自美国Promega公司；DOTAP脂质体转染试剂、RNA提取试剂Tripure、DEPC购自美国Roche公司；DMEM高糖培养基、 标准小牛血清购自美国Hyclone公司。

    吕伟，等. Stat3靶向RNA干扰重组体的构建及鉴定  1.2  方法

    1.2.1  siRNA表达载体的构建和鉴定    根据NCBI提供的人类Stat3基因结构(Gene ID:6 774)，以及siRNA设计的技术要求，用“siRNA Sequence Selector”()设计针对Stat3特异的siRNA序列(19nt)：TGCATAGGACGGAATGAAC，以BLAST分析所设计序列的特异性。构建siRNA表达载体的模板序列为：5'?TCGACTGCATAGGACGGAATGAACAAGCGTTCATTCC?GTCCTATGCATTTTTT?3'；5'?CTAGAAAAAA?TGCATAGGACGGAATGAACGCTTGTTCAT?TCCGTCCTATGCAG?3'。寡核苷酸链由上海生物工程技术公司合成，核苷酸链在退火缓冲液中退火后, 与SalⅠ，XbaⅠ双酶切的线性化Pavu6＋27载体连接，连接产物转化感受态细菌JM109，挑选单菌落，筛选重组体，重组体命名为：Pavu6＋27?Stat3(图1)。重组体质粒用Hind Ⅲ和BamHⅠ限制性内切核酸酶进行双酶切，阳性克隆送上海生工生物公司检测核苷酸序列。

    图1  构建重组表达载体技术路线图

    1.2.2  细胞培养及转染    细胞培养于含10%灭活小牛血清、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养液中，于37 ℃、体积分数为5% CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。采用Roche公司的DOTAP脂质体转染试剂盒包裹经灭菌处理的重组质粒(质粒∶脂质体=1∶6)。转染前1 d，换取新鲜培养液(含10%小牛血清的DMEM高糖培养液，37 ℃，体积分数为5% CO2孵箱中培养)后调整浓度为2×105/ml，以每孔2 ml接种于6孔培养板中培养，待细胞增至60%～80%时，将质粒?脂质体复合物转染至细胞中，18 h后弃去转染液，换新鲜培养液继续培养，弃去原培养液，用含G418 300 μg/ml的DMEM培养液进行筛选收集G418抗性细胞。转染了Pavu6＋27?Stat3 siRNA的HCT116细胞简写成Pavu6＋27?Stat3 siRNA HCT116细胞。转染空质粒的Pavu6＋27的HCT116细胞简写成Pavu6＋27 HCT116作为对照。

    1.2.3  半定量RT?PCR法检测Stat3 mRNA表达［7］    Pavu6＋27?Stat3 siRNA HCT116细胞中Stat3?mRNA表达改变，以Pavu6＋27 HCT116为对照。收集培养的2种细胞分为4组,按Tripure操作说明，分别提取总RNA，紫外分光光度计定量，调整浓度为1 g/L。取2 μl Total RNA 与1 μl Oligo (dT) 70 ℃ 5 min，置于冰浴5 min，加2 μl 10 mmol/L dNTP混合，5 μl 5×Buffer，1 μl MMLV反转录酶，1 μl RNAsin，去离子水补至25 μl。42 ℃ 60 min，-20 ℃冻存。PCR反应体系为：2 μl反转录产物(模板)，两对引物各1 μl(选用看家基因甘油醛?3?磷酸脱氢酶GAPDH基因作为内参照，GAPDH上游引物的序列为5'?AATTCAACGGCACAGTCAAGGC?3'，下游引物的序列为5'?GGATGCAGGGATGATGTTCTGG?3'，扩增片段为467 bp。Stat3上游引物序列为5'?GTCAGATGCCAAATGC?3'，下游引物的序列为5'?CCTGGAGGCTTAGTGC?3'，扩增片断长度386 bp，引物序列设计合成均由大连Takara公司完成)。2.5 μl 10×Buffer，2 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10 mmol/L dNTP混合，0.5 μl Taq酶，去离子水补至25 μl。反应条件为：预变性94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min共30个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μl产物2%琼脂糖凝胶电泳，对照分子量标准检测扩增结果，Gel?Doc 2000型凝胶成像分析系统对目的DNA条带进扫描，用Image?glub 4.0分析软件测得电泳图谱上每条基因条带的光密度值。各个样本Stat3强度与GAPDH内对照强度的比值，从而反映Stat3表达的变化。用t检验对所得结果进行统计学处理， 以P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结果

    2.1  重组质粒酶切鉴定

    Pavu6＋27?Stat3重组体质粒经Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切后呈3条带，分别为6.2 kb的载体片段、348 bp和397 bp的小片段。空载体双酶切后出现两条带，6.2 kb的载体片段，348 bp和353 bp不能分开，融为一条带(图2)。

    2.2  重组质粒测序鉴定

    将重组质粒Pavu6＋27?Stat3送上海生工测序，引物序列根据Pavu6＋27载体序列，采用Primer Premier5.0设计为：5'?CCCAAGCTTGGATCCAA?GGTCGGGC?3'。结果表明siRNA表达模板成功构建于Pavu6＋27载体上，序列完全正确(286～338)与目的序列相同。

    2.3  半定量RT?PCR结果

    Stat3和GAPDH引物的扩增基因片段经电泳和EB染色后，结果显示扩增片段大小与所设计的大小完全一致，分别为386 bp和467 bp，为电泳染色后结果，1～4泳道为对照，5～8泳道为实验组。可见,重组体Pavu6＋27?Stat3 siRNA转染的HCT116中Stat3?mRNA的表达较空载体Pavu6＋27转染的HCT116细胞中Stat3?mRNA表达量显著下降(图3A)。统计分析结果表明，重组体Pavu6＋27?Stat3 siRNA转染的HCT116中Stat3?mRNA的表达较空载体Pavu6＋27转染的HCT116细胞中Stat3?mRNA表达量显著下降。Stat3?mRNA扩增产物的强度与内对照GAPDH的比值在对照组和实验组分别为0.974±0.034和0.612±0.063，实验组约降低为对照组的60.4%(P<0.01,n=4)(图3B)。

     3  讨  论

    Stat3信号传导通路接受生长因子、细胞因子等细胞外信号刺激，通过借助细胞内的一类具有激酶结构的连接蛋白JAKs(janus Kinase)磷酸化而被激活从而完成信息转导。研究表明多种与肿瘤增殖凋亡相关的细胞因子如：生长激素(GH)、干扰素(IFN)、白细胞介素(IL?2、IL?6)等都通过JAKs Stat通路最终影响基因的转录调节［8］。在此通路中Stat3单体通过SH2结构域与另一个Stat3分子磷酸化的酪氨酸残基相互作用形成二聚体进入细胞核内与特异的DNA片段结合，调控靶基因转录，影响细胞的增殖、分化和凋亡。如能设法阻断癌细胞内Stat3基因的表达，定会大大减弱癌细胞增殖能力同时减弱凋亡抑制。阐明Stat3在肿瘤细胞凋亡抑制和增殖中的作用，可为肿瘤提供新的靶点，具有重要的理论意义和实际应用前景。

    近几年来兴起的RNA干扰技术， 尤其是siRNA为肿瘤的生物治疗开辟了新的途径［9］。与传统基因沉默技术相比，具有效果强、持续时间长、技术流程简便、短周期，在细胞内表达的稳定性、可传递性、高效性等优势已经使这一技术在肿瘤的基因治疗方面显示出诱人的前景［6］。

    实验采用的载体pAVU6+27属于采用U6启动子的质粒载体，被证实是具有良好siRNA表达效率的载体。报道，该载体能诱发高达80%～90%的基因沉默效率［10］。本实验已经成功构建了阻断Stat3基因表达的RNAi序列，并已克隆至载体Pavu6＋27中，经酶切和DNA测序鉴定完全正确。采用脂质体法转染人结肠癌HCT116细胞株后获得了siRNA的表达，经RT?PCR检测发现实验组Stat3?mRNA表达抑制率为60.4%，明显低于空质粒转染组，提示重组载体通过RNAi有效阻断Stat3基因的表达，从而为下一步的利用重组载体进行肿瘤治疗的实验研究打好了基础。

【文献】
  ［1］ Buettner R, Mora L B, Jove R. Activated Stat signaling in human tumors provides novel molecular targets for therapeutic intervention［J］. Clin Cancer Res,2002,8(4):945-954.

［2］ Mora L B, Buettner R, Seigne J, et al. Constitutive activation of Stat3 in human prostate tumors and cell lines: direct inhibition of Stat3 signaling induces apoptosis of prostate cancer cells［J］. Cancer Res,2002,62(22):6659-6666.

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［4］ Trovato M, Vitarelli E, Grosso M, et al. Immunohistochemical expression of HGF, c?MET and transcription factor Stat3 in colorectal tumors［J］. Eur J Histochem,2004,48(3):291-298.

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［6］ Elbashir S M, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21?nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］. Nature,2001,411(6836):494-498.

［7］ 奥斯伯 F，布伦特 R,金斯顿 R E,等.精编分子生物学实验指南［M］.北京：出版社，1998.

［8］ Ahmed?Choudhury J, Williams K T, Young L S, et al. CD40 mediated human cholangiocyte apoptosis requires JAK2 dependent activation of Stat3 in addition to activation of JNK1/2 and ERK1/2［J］. Cell Signal,2006,18(4):456-468.

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［10］Paul C P, Good P D, Winer I, et al. Effective expdression of small interfering RNA in human cells［J］. Nat Biotechnol,2002,20(5):505-508.