IV期非小细胞肺癌组织βⅢ?tubulin表达与紫杉类化疗耐药相关

               作者：杨俊泉，高献书，刘宏侠，韩春

【摘要】  目的：探讨Ⅳ期非小细胞肺癌(NSCLC) βⅢ?tubulin表达与紫杉类化疗耐药性关系. 方法： 回顾性分析75例接受以紫杉类化疗的Ⅳ期NSCLC临床病理资料. 免疫组织化学法检测肿瘤标本βⅢ?tubulin蛋白表达，并对化疗疗效及生存时间进行分析. 结果： βⅢ?tubulin阳性表达率（≥50%阳性染色细胞）为58.7% (44/75)，与性别、年龄及组织类型无关. 化疗有效率（CR+PR）为34.7%，βⅢ?tubulin高表达患者紫杉类化疗有效率低（25.0%)，进展率高(25.0%)，而βⅢ?tubulin低表达患者化疗有效率高（48.9%)，进展率低（6.4%)，P值分别为0.036和0.037. βⅢ?tubulin高表达者有较短的中位OS（12 mo）和PFS（8 mo），而βⅢ?tubulin低表达患者有较长的中位总生存期（OS）（15 mo）和无进展生存期（PFS）（11 mo）， P=0.018. 结论： βⅢ?tubulin高表达NSCLC患者对紫杉类药物耐药且预后不良.

【关键词】  非小细胞肺癌；紫杉醇；微管蛋白；抗药性；免疫组织化学

　　【Abstract】 AIM: To investigatethe the relationship between the expression of βⅢ?tubulin protein and chemoresistance to taxane in non?small cell lung cancer (NSCLC). METHODS: Seventy?five patients with stage  Ⅳ NSCLC treated with taxane were enrolled in this study and their clinical data were analyzed retrospectively. The expression of βⅢ?tubulin protein in tumor samples was detected by the immunohistochemical methods. The data of therapeutical effect and survival time were collected and analyzed. RESULTS: The βⅢ?tubulin positive staining rate（≥50% of stained cells） accounted for 58.7% (44/75). There was no correlation between βⅢ?tubulin positive expression and age, gender, and pathological type. The response rate (CR+PR) was 34.7%. Patients with βⅢ?tubulin overexpression displayed less response rate and more progression rate to taxane (response rate 25.0%, PD 25.0% in patients with ≥50% of stained cells vs response rate 48.89%, PD 6.5% in patients with <50%, P=0.036 and P=0.037, respectively). Overexpression of βⅢ?tubulin protein expression was correlated with shorter median overall survival (12 months） and progression?free survival (8 months), While a low level of  βⅢ?tubulin protein expression was correlated with longer median overall survival (15 months) and progression?free survival (11 months), P=0.018. CONCLUSION: Overexpression of βⅢ?tubulin in tumor cells is associated with resistance to taxane and a poor prognosis in patients with NSCLC receiving taxane ?based chemotherapy.

　　【Keywords】 non?small cell lung cancer; paclitaxel; tubulin; drug resistance; immunohistochemistry

　　0引言

　　肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤相关死亡原因中占第一位. 非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的80%～85%. Ⅳ期患者约占NSCLC的40%，其5 a生存率约为1%. 紫杉醇和多西紫杉醇等与铂类联合的有效率也仅为30%～40%，肿瘤耐药性的产生是化疗失败的最主要因素. 研究表明，βⅢ?tubulin表达与紫杉类耐药密切相关［1］. 国内未见到βⅢ?tubulin蛋白表达与NSCLC紫杉类耐药方面研究报道，我们回顾性分析75例Ⅳ期NSCLC的βⅢ?tubulin蛋白表达，探讨其表达与紫杉类化疗效的关系.

　　1对象和方法

　　1.1对象

　　唐山市人民2003?10/2007?10有完整随访资料的Ⅳ期NSCLC患者75例，年龄≤75岁，体力状况Karnofsky（KPS）评分≥80分. 有标本供病检测. 男49例，女26例，男女比为1.88∶1；中位年龄为58（41～73）岁，≥58岁38例，＜58岁37例；鳞癌39例，腺癌36例. 化疗前行严格的分期检查，包括胸部CT，腹部CT或B超，全身骨骼核素扫描，常规检查心、肺、肝、肾等功能. 化疗采用以紫杉类＋DDP联合化疗方案：紫杉醇175 mg/m2  d1，DDP 75mg/m2  d2，每3 wk一疗程；多西紫杉醇75 mg/m2，顺铂75 mg/m2，每3 wk一疗程；连续2～6次. 病理组织分型按WHO 1998组织学分类标准，分期按1997年国际抗癌连盟(UICC)制订的标准. 随访2007?10，结果存活11例，死亡64例，生存期从确诊日至死亡或2007?10，以 mo 为时间单位，中位随访时间13（4～30）mo. 接受基于紫杉类化疗2～6周期，无CR患者，PR 26例（34.7%），总有效率（CR+PR）为34.7%，SD 36例（48.0%）,控制率（CR+PR+SD）为82.7%，PD 13例（17.3%）. 中位总生存期为13 mo，中位无进展生存期为9 mo. 一抗兔抗人βⅢ?tubulin mAb试剂盒购自美国Cell Signal公司，SP免疫组织化学试剂盒购于福州迈新有限公司.

　　1.2方法

　　采用SP免疫组化法检测βⅢ?tubulin蛋白表达，βⅢ?tubulin抗体工作浓度均为1∶100，以内皮细胞或神经细胞染色为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，免疫组织化学流程Seve等［1-2］进行. 染色结果采用双盲法阅片判断，Olympus光学显微镜高倍镜下随机选择5个视野，每个视野记数100个细胞. βⅢ?tubulin主要均匀的位于正常细胞和肿瘤细胞的胞质，呈黄色或棕黄色颗粒，以内皮细胞或神经细胞染色为阳性参考标准. 染色强度0分为无染色，2分为强度至少相当于内皮细胞或神经细胞，2分以上的细胞为阳性细胞. 样品含<50%的阳性染色细胞为βⅢ?tubulin (-)即低表达，≥50%阳性染色细胞为βⅢ?tubulin (+)即高表达. 疗效按WHO 实体瘤标准判定分为：CR（complete response，完全缓解），PR（partial response，部分缓解），SD（stable disease，疾病稳定），PD（progression disease，疾病进展）. 近期客观有效为CR+PR，有效者应1 mo后检查确认. CR+PR+SD为肿瘤控制. 总生存期（overall survival，OS）为自首日至死亡日或失访日，无进展生存（progression free survival，PFS) 指自治疗首日至病变进展日，均以 mo 计.

　　统计学处理：应用SPSS13.0统计软件包，蛋白表达与临床病理指标采用χ2检验；两蛋白表达之间的比较采用Spearman等级相关；预后判断采用Kaplan?Meier生存分析、Log?rank时序检验分析方法；P<0.05为具有统计学意义.

　　2结果

　　75例NSCLC组织βⅢ?tubulin (+)，即高表达率为58.7%(44/75)，其中男性高表达率为61.2%（30/49），女性53.8%（14/26）；鳞癌53.8%（21/39），腺癌63.9%（23/36）；≥58岁68.4%(26/38)，＜58岁48.6%(18/37)；经χ2检验，P＞0.05，无统计学意义（图1A,B）. βⅢ?tubulin低表达患者有效率为48.9%，而βⅢ?tubulin高表达有效率为25.0%，差异显著(P=0.036). βⅢ?tubulin低表达患者进展率为6.4%，βⅢ?tubulin高表达者为25.0%，有统计学意义(P=0.037). βⅢ?tubulin低表达患者中位OS和PFS分别为15和11 mo，而βⅢ?tubulin高表达者分别为12和8 mo，经Log?rank检验，有统计学意义（P＜0.05，图2A，B）.

　　3讨论

　　化疗是晚期NSCLC的主要手段，而紫杉类药物（包括紫杉醇和多西紫杉醇）是NSCLC的常用化疗药物. 紫杉类的耐药性（包括原发性耐药和继发性耐药）是限制其临床应用的主要原因之一. 微管(microtubule)是构成细胞骨架的主要成分，由13 条原纤丝纵向排列构成中空的圆柱状结构，每条原纤丝是tubulin α和β形成的异二聚体组装成的多聚体. 有研究认为β?tubulin基因TUBB突变可能与紫杉类耐药相关. TUBB突变可能通过两种机制导致紫杉类药物的耐药：①TUBB基因突变影响了tubulin与紫杉类药物的结合位点，但微管蛋白功能却不受影响；②TUBB基因突变改变了与微管聚合相关的微管蛋白二聚体的重要区域，削弱了相互作用，导致微管不稳定. 但是，关于TUBB基因突变的继续研究却得出了不同的结论. Kelley等［3］通过对25 种NSCLC细胞株和20例原发性NSCLC研究发现，TUBB突变并不常见，先前的关于NSCLC中TUBB基因突变的研究可能是假基因(pseudogenes)共扩增引起的人为现象. 已知的β?tubulin假基因分布在同源染色体6和1，8，19染色体上. 所以那种表面上的TUBB突变与耐药、预后相关的假象可能与肿瘤的非整倍性相关. Mozzetti等［4］用半定量RT?PCR，实时定量PCR和定量免疫组织化学法检测41例晚期卵巢癌，发现紫杉醇耐药组βⅢ?tubulin mRNA水平和蛋白蛋白表达显著增高（P<0.01）. Rosell等［5］用定量PCR法检测28例接受紫杉醇+卡铂化疗的NSCLC患者石蜡组织中βⅢ?tubulin mRNA的表达，βⅢ?tubulin mRNA低水平（cutoff=0.5)组PR为55.6%（5/9），βⅢ?tubulin mRNA高水平组PR率为9.1%(1/11)，P=0.05. 15例βⅢ?tubulin mRNA低水平（cutoff=1)患者中位进展时间为6.8 mo，7例高水平患者为4.2 mo. Paradiso等［6］用免疫组织化学法分析70例基于紫杉醇化疗的晚期乳腺癌，发现βⅢ?tubulin蛋白低表达组肿瘤控制（CR+PR+SD）率和进展（PD）率分别为98%和2%，而高表达组控制率和进展率分别为62%和38%(P=0.000)，有显著性差异. Cox回归分析显示，在基于紫杉醇化疗的晚期乳腺癌患者临床进展相关因素中，βⅢ?tubulin的OR值为28.789，95% CI（3.212~28.072），P=0.004. 本组病例显示，近期疗效中βⅢ?tubulin低表达患者有效率为48.89%，而βⅢ?tubulin高表达有效率为25.0%，差异显著(P=0.036). βⅢ?tubulin低表达患者进展率为6.45%，而βⅢ?tubulin高表达者为25.0%(P=0.037)，均有统计学意义. 与［4-6］结果基本一致，即βⅢ?tubulin高表达NSCLC患者紫杉类化疗后控制率低，进展率高，而βⅢ?tubulin低表达患者控制率高，进展率低. 表明βⅢ?tubulin表达与紫杉类化疗耐药相关. 在生存期方面，Kaplan?Meier 分析显示：βⅢ?tubulin低表达NSCLC患者中位OS和PFS分别为15和11 mo，而βⅢ?tubulin高表达者分别为12和8 mo，经Log?rank检验，有统计学意义(P＜0.05). 与文献［1，5］结果一致，即βⅢ?tubulin高表达患者OS和PFS短，而βⅢ?tubulin低表达患者OS和PFS长，表明βⅢ?tubulin高表达是紫杉类化疗后患者预后不良的一个指标. 综上所述，Ⅳ期NSCLC标本βⅢ?tubulin高表达者对紫杉类药物耐药，βⅢ?tubulin低表达NSCLC患者对紫杉类药物敏感. βⅢ?tubulin高表达NSCLC患者预后不良. 

【文献】
  　　［1］Seve P, Mackey J, Isaac S, et al. Class III beta?tubulin expression in tumor cells predicts response and outcome in patients with non?small cell lung cancer receiving paclitaxel［J］. Mol Cancer Ther, 2005, 4(12):2001-2007.

　　［2］Seve P, Isaac S, Tredan O, et al. Expression of class III {beta}?tubulin is predictive of patient outcome in patients with non?small cell lung cancer receiving vinorelbine?based chemotherapy［J］. Clin Cancer Res, 2005, 11(15):5481-5486.

　　［3］Kelley MJ, Li S, Harpole DH. Genetic analysis of the beta?tubulin gene, TUBB, in non?small?cell lung cancer［J］. J Natl Cancer Inst, 2001, 93(24):1886-1888.

　　［4］Mozzetti S, Ferlini C, Concolino P, et al. Class III beta?tubulin overexpression is a prominent mechanism of paclitaxel resistance in ovarian cancer patients［J］. Clin Cancer Res, 2005, 11(1):298-305.

　　［5］Rosell R, Scagliotti G, Danenberg KD, et al. Transcripts in pretreatment biopsies from a three?arm randomized trial in metastatic non?small?cell lung cancer［J］. Oncogene, 2003, 22(23):3548-3553.

　　［6］Paradiso A, Mangia A, Chiriatti A, et al. Biomarkers predictive for clinical efficacy of taxol?based chemotherapy in advanced breast cancer［J］. Ann Oncol, 2005, 16(Suppl 4): 14-19.