TNF?α对TP酶的调节及其对5?FU前体药作用的影响

【摘要】  目的： 探讨TNF?α对胸苷磷酸化酶（TP酶）的调节及其与5?FU前体药化疗敏感性的关系. 方法： 应用TNF?α诱导肿瘤细胞中的TP酶，ELISA法检测肿瘤组织中TP酶蛋白水平，采用MTT法检测药物敏感性变化. 结果：大肠癌细胞株Lovo和SW620中未检测到TP酶，乳腺癌细胞株MCF?7中的TP酶含量为（30.1±1.4） μg/g，高于MCF/ADR的TP酶（18.8±0.4） μg/g. TNF?α上调MCF?7和MCF/ADR中TP酶表达呈时间和剂量依赖性. 耐药株MCF/ADR中TP酶上调高达（28.4±1.2） μg/g，未达非耐药细胞株水平. MCF?7细胞中TP酶上调1.27倍，对氟铁龙的IC50降低了1.33倍，有统计学意义. 结论： TNF?α能剂量?时间依赖性上调肿瘤细胞的TP酶，TNF?α为5?FU前体药化疗增效.

【关键词】  胸苷磷酸化酶；氟尿嘧啶；氟尿苷；卡培他滨；肿瘤坏死因子?α

　　【Abstract】 AIM： To explore the regulative action of TNF?α on thymidine phosphorylase(TP) and its effect on the sensitivity of prodrug to 5?fluorouracil(5?FU) in cancer cell lines. METHODS： The TP level of tumor cells was mearsured by ELISA.  And then the MTT assay was done for detecting the drug sensitivity of the cells treated with small concentration of TNF?α. RESULTS： The TP in Lovo or SW620 was not displayed, and it was significantly higher in MCF?7［(30.1±1.4)μg/g］than in MCF/ADR［（18.8±0.4）μg/g］. TNF?α  caused a concentration and time dependent increase in the level of TP. The TP level of MCF?7 displayed a 1.27?fold increase, while its IC50 displayed a 1.33?fold decrease. CONCLUSION： TNF?α can cause a concertration and time dependent increase in the level of TP and enhance the sensitivity of MCF?7 to 5?FU.

　　【Keywords】 thymidine phosphorylase; fluorouracil; floxuridine; capecitabine; tumor necrosis factor?alpha

　　0引言

　　胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP酶）是近年来发现的嘧啶核苷代谢过程中的一个关键酶，是5?FU前体药物（卡培他滨、脱氧氟尿苷）转化为氟尿嘧啶的最后一个限速酶. 近来一些研究表明，胸苷磷酸化酶与肿瘤的化疗关系密切，它能增强患者对5?氟尿嘧啶(5?FU)前体药物化疗的敏感性，提高化疗效果，改善肿瘤患者的预后［1］. TNF?α，INF?γ等多种因子能够上调肿瘤细胞内TP酶的表达. 我们应用TNF?α诱导结肠癌和乳腺癌细胞中TP上调并观察其对5?FU前体药物的细胞毒作用，为指导临床用药提供理论依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人结肠癌细胞株Lovo和SW620；乳腺癌细胞株MCF?7和MCF?7/ADR由天津肿瘤中心实验室保存. RPMI1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司，MTT和DMSO为Sigma公司产品. 氟铁龙为上海罗氏制药有限公司生产；5?FU(250 mg/支)为天津金耀氨基酸有限公司生产；重组改构人TNF?α（5 MU/支）为上海赛达生物药业有限公司生产. TP酶检测试剂盒为罗氏诊断公司提供. BCA蛋白浓度测定试剂盒为碧云天生物技术研究所提供.

　　1.2方法
 
　　1.2.1TNF?α对肿瘤细胞中TP酶的调节将长满培养瓶对数生长期细胞用无菌PBS洗涤后加入2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞，800 r/min离心8 min，加入培养液调整细胞密度为4×109/L. 每瓶加入细胞悬液1 mL，再加入培养液4 mL. 37℃，50 mL/L CO2，饱和湿度培养箱继续培养24 h. 弃去原培养液，加入含20，200，1000 kU/L TNF?α的新鲜培养液，继续培养48 h，消化、收集、冻存细胞. 另培养24 h后弃去原培养液，加入含TNF?α的新鲜培养液，使培养液中TNF?α的浓度为200 kU/L，继续培养24，48，72，96  h，消化、收集、冻存细胞. 取出-80℃冰箱中冻存的细胞，反复冻溶5次，使细胞充分裂解. Eppendorff离心5 min（13 000 r/min），后收集上清150 μL. 按照说明书利用BCA法检测上清液蛋白浓度，ELISA检测肿瘤细胞中胸苷磷酸化酶水平. 应用SPSS统计分析软件，绘制标准曲线，再根据测得的A值出TP酶浓度. 肿瘤细胞中的TP酶含量（μg/g）=样品TP酶浓度（μg/L）/上清液蛋白质的浓度（g/L）.

　　1.2.2MTT法检测药物敏感试验将对数生长期细胞接种于96孔培养板，每孔加入细胞悬液200 μL（1×104个），置37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养24 h. 弃去原培养液，分别加入含有药物（5?FU，5?dFUrd）的不同浓度（100，10，1，0.1，0.01 mg/L）的新鲜培养液200 μL（每孔设3个复孔），继续培养48~120 h. 每孔加5 g/L MTT 20 μL，培养4 h后，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振动10 min，用酶标仪测定每孔A570 nm. 计算化疗药物的抑制率=（1-实验孔A570/对照孔A570）×100%. 选择一个对细胞生长无影响的TNF?α剂量200 kU/L. 将对数生长期细胞用含有TNF?α 200 kU/L的培养液培养细胞24，48，72，96 h后按照MTT法继续检测5?FU和氟铁龙的敏感性.

　　统计学处理： 计量资料用x±s表示，应用SPSS统计软件进行方差分析，P<0.05为有统计学差异.

　　2结果

　　2.1TNF?α对肿瘤细胞株TP酶表达的调节大肠癌细胞株Lovo，SW620均未检测到TP酶蛋白；乳腺癌MCF?7细胞株TP酶浓度为（30.1±1.4） μg/g，耐药株MCF?7/ADR的TP酶蛋白浓度为（18.8±0.4） μg/g，低于非耐药株（P<0.01）. 当TNF?α浓度为1000 kU/L时，原无TP酶表达的Lovo细胞TP酶蛋白表达水平升高到22.5 μg/g，减低TNF?α浓度不能使Lovo细胞中TP酶浓度上升，增加浓度Lovo细胞大量死亡. MCF?7细胞应用TNF?α处理后，TP酶蛋白表达水平随着浓度的逐渐升高而增加，具有剂量依赖性. 差异具有统计学意义（P<0.01）. MCF/ADR细胞应用TNF?α处理后，TP酶蛋白表达水平有所升高，但上升幅度不大，也表现出剂量依赖性（P<0.05）. 但未达到非耐药的MCF?7细胞株的TP酶蛋白表达水平（表1）. 应用200 kU/L的TNF?α处理MCF?7细胞后随培养时间延长细胞TP酶蛋白表达呈上升趋势，在48 h达高峰，此后持续TP酶蛋白表达较高水平至96 h（仍为起始时的1.9倍）. 而MCF/ADR应用200 kU/L的TNF?α处理后，TP酶有所上升，但幅度较小，未达到MCF?7起始水平. Lovo 细胞在TNF?α  200 kU/L作用72 h TP酶蛋白仍为0（表2）.表1TNF?α对肿瘤细胞中TP酶的调节（略）表2200 kU/L TNF?α 作用不同时间后乳腺癌细胞系中TP酶的变化（略）

　　2.25?FU类药物的细胞毒作用 96 h 5?FU和氟铁龙对Lovo和MCF?7的生长抑制作用呈现明显的剂量依赖性（图1A）. 氟铁龙对Lovo和MCF?7的IC50 (mg/L)高于5?FU，为5?FU的7.47～40.57倍，其差异有统计学意义［（31.65 ±1.14） vs (0.78±0.01)，(12.85±0.29) vs (1.72±0.03)，P<0.01）］. 两种药物对Lovo和MCF?7的抑制作用呈时间依赖关系，低剂量的5?FU在短时间内即产生生长抑制作用，氟铁龙起效时间较为缓慢（图1B）. 选择对肿瘤细胞生长无抑制作用的TNF?α剂量（200 kU/L）培养肿瘤细胞24，48，72 h后，应用MTT检测MCF?7细胞对5?FU类药物的敏感性无提高（P>0.05）. 但能提高MCF?7对氟铁龙的敏感性. IC50在TNF?α作用48 h最低（表3）.表3200 kU/L TNF作用时间与MCF?7细胞对FU类药物敏感性的关系（略）

　　3讨论

　　大量资料证明，癌组织中的TP酶明显高于癌旁正常组织［2-3］. 且TP酶主要分布于肿瘤基质，尤其是肿瘤相关巨噬细胞，其次在肿瘤细胞. 我们发现： 大肠癌Lovo，SW620细胞均未检测到TP酶，与张继民等［4］报道不符，其原因可能是由于实验体系不同加之肿瘤细胞本身TP酶蛋白含量很少所致. 而乳腺癌细胞株MCF?7（30.1±1.4） μg/g及其耐药株MCF/ADR（18.8±0.4） μg/g中均检测到TP酶，但耐药株TP酶浓度明显低于非耐药株，也进一步说明了不同肿瘤细胞之间TP酶表达水平存在明显的差异［5］. TNF?α能上调肿瘤细胞MCF?7，MCF/ADR中的TP酶，且表现出时间、剂量依赖性，其上调机制尚不十分清楚，TNF?受体R2起了重要作用［6］. 5′?dFUrd（氟铁龙）仅需要在肿瘤细胞中经TP酶的一步催化作用即可转化为有细胞毒作用的5?FU. 本试验结果显示：氟铁龙对Lovo细胞的IC50为（31.6 ±1.1） mg/g，为5?FU的40.57倍，起效时间较5?FU缓慢，但是临床上确实有大量的结肠癌对氟铁龙有效，由此提出，氟铁龙对大肠癌细胞的杀伤作用可能是通过间质细胞中的TP酶作用而实现的，Lovo细胞对氟铁龙不敏感的原因可能是由于Lovo细胞中无TP酶存在. 以上结果证明了TP酶在5?FU前体药物转化过程中的重要性.

　　本结果还表明TNF?α作用后的Lovo细胞对5?FU和氟铁龙的敏感性并没有提高. 而TNF?α 200 kU/L作用于MCF?7细胞后，MCF?7对氟铁龙的敏感性却有明显提高，而对5?FU的化疗敏感性影响不大. 实验数据可以看出，TP酶活性提高1.27倍，MCF?7对氟铁龙的敏感性提高了1.34倍. 我们也发现，TNF?α增强氟铁龙的抗癌活性并不满意，上调后的IC50仍然高于直接应用5?FU. 由于本实验是体外实验，推测应用于动物模型或人体后由于肿瘤间质细胞、肿瘤相关巨噬细胞中TP酶的作用，可能会进一步增加氟铁龙的敏感性. TNF?α具有杀伤或抑制肿瘤细胞和多种免疫调节功能，但是由于副作用较大，为TNF?α的临床应用造成困难. 如果将TNF?α作为一种增效剂，小剂量应用，副作用将减少. 某些抗肿瘤药物与TNF?α联合应用，既可减少各种药物的用量、降低毒副作用，又可提高疗效，不失为肿瘤治疗的一种可行方法.

【】
  　　［1］Ma T, Zhu ZG, Ji YB, et al. Correlation of thymidylate synthase, thymidine phosphorylase and dihydropyrimidine dehydrogenase with sensitivity of gastrointestinal cancer cells to 5?fluorouracil and 5?fluoro?2′?deoxyuridine［J］. World J Gastroenterol, 2004, 10(2):172-176.

　　［2］Guo L, Kuroda N, Toi M, et al. Increased expression of platelet?derived endothelial cell growth factor in human hepatocellular carcinomas correlated with high Edmondson grades and portal vein tumor thrombosis［J］.Oncol Rep, 2001, 8(4):871-876.

　　［3］Saito S, Tsuno N, Nagawa H, et al. Expression of platelet?derived endothelial cell growth factor correlates with good prognosis in patients with colorectal carcinoma［J］.Cancer,2000,88(1):42-49.

　　［4］张继民，刘明姬，遘井贤幸, 等.结直肠癌组织中巨噬细胞表达胸苷磷酸化酶并与血管新生相关［J］. 中华胃肠外科杂志，2003，6（4）：247-250.

　　［5］Tsujitani S, Saito H, Maeta Y, et al. Neoangiogenesis in patients with gastric carcinoma in relation to the expression of vascular endothelial growth factor and thymidine phosphorylase［J］. Anticancer Res, 2004, 24(3b):1853-1859.

　　［6］Zhu GH, Schwartz EL.Expression of the angiogenic factor thymidine phosphorylase in THP?1 monocytes:Induction by autocrine tumor necrosis factor and inhibition by aspirin［J］. Mol Pharmacol, 2003, 64:1251-1258.