GST?Pi三位点等位基因组合分布与难治性癫痫的相关性

             作者：杨娟，黄祖春，张婧，王雪峰，席志琴，谢正祥

【摘要】  目的： 探索谷胱苷肽S?转移酶Pi （GST?Pi）基因3个位点（Ile105Val，Ala114Val，Asp147Tyr）的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）的基因组合分布与难治性癫痫的相关性. 方法： 采用等位基因特异性引物PCR技术对非难治性癫痫组、难治性癫痫组、正常组进行GST?Pi 3个位点SNPs的检测. 结果： 正常组与癫痫组（包括难治性和非难治性两组）3个位点中单个位点的基因型构成在两组间差异均有统计学意义(P<0.0001). 从组合基因来分析，两个位点均变异的癫痫组20例(21.74%)高于正常组10例(2.17%)，差异有统计学意义(P<0.0001); 3个位点均变异的癫痫组68例(78.91%)高于正常组3例(6.52%), 非难治性癫痫组41例(83.67%)高于难治性癫痫组27例(62.79%)，差异均有统计学意义(P<0.0001). 结论： GST?Pi基因变异尤其是多个位点变异的人群易患癫痫，而多个位点变异的患者不易成难治性癫痫.

【关键词】  单核苷酸多态性；癫痫；谷胱甘肽转移酶；组合分布

　　【Abstract】AIM：  To study single nucleotide polymorphisms(SNP) in the 3 sites(Ile105Val, Ala114Val, Asp147Tyr) of GST?Pi and the association between distribution of component genotype and drug?resistant epilepsy. METHODS: The SNPs of the three sites of GST?Pi for healthy people, drug?responsive epilepsy and drug?resistant epilepsy were genotyped by allele?specific primer?polymerase chain reaction (ASP?PCR) technique. RESULTS：  Genotype distribution of every site among the 3 sites is different significantly between healthy group and epilepsy group (P<0.0001). A situation wss that 2 sites of 3 mutated, of which there were 20(21.74%) people in epilepsy group and 10(2.17%) people in control group, and the former was obviously higher than the latter(P<0.0001). Another situation was that all of 3 sites mutated, of which there were 68(78.91%) people in epilepsy group, 3(6.52%) people in control group, and the former was obviously higher than the latter(P<0.0001).The same as foregoing, 41(83.67%) people in drug?responsive epilepsy group and  27(62.79%) people in drug?resistant epilepsy group, and the former was obviously higher than the latter(P<0.0001). CONCLUSION： People with mutated gene are easy to get epilepsy, obviously the people with mutated gene of multitude sites, but these people are not easy to develop drug?resistant epilepsy. 

　　【Keywords】 single nucleotide polymorphisms; epilepsy; component genotype; allele

　　0 引言
    
　　目前国内外有关与癫痫相关的基因研究较多的有白介素?1 R (inter leukin?1 R, IL?1R)基因，IL?1受体抗体(IL?1 receptor antagonist, IL?111a)基因、载脂蛋白E (apolipo protein E, ApoE) S4等位基因、GABA基因及朊蛋白基因(prion protein, PRNP). 而对难治性癫痫的研究多围绕多药耐药家族进行. 有研究［1］表明在人群中表达P?gp的多耐药基因(multidrug resistance, MDR1)的基因多态性与难治性癫痫有相关性，而多药耐药组基因中的GST?Pi基因的多态性与难治性癫痫的关系尚少见报道，且目前其它关于基因多态性与整体生理和疾病表现型联系的研究，多数只局限于单个基因，甚至是单个位点的多态性［2-3］. 我们通过观察GST?Pi 3位点SNPs的组合分布与难治性癫痫的相关性，旨在分析GST?Pi基因变异是否逃逸难治性癫痫的发生.

　　1  对象和方法

　　1.1  对象  选择重庆医科大学附属第一癫痫门诊患者104例. 其中非难治性癫痫患者55（男31，女24）例；难治性癫痫患者49（男28，女21）例. 患者年龄［39±4（9～58）］岁. 所有癫痫患者均符合国际抗癫痫联盟1981发作分类［4］，其中难治性癫痫组患者符合国内难治性癫痫诊断标准［5］. 正常对照组随机选择重庆医科大学附属第一医院体检中心健康个体70(男38，女32)例，年龄［41±2（23～65）］岁. 入选标准：血压<140/90 mmHg; 无心、脑、肾、肝胆、糖尿病等病史；心电图、尿常规、肝肾功能、血糖及血脂均正常者. DYY?11型电脑三恒多用电泳仪，WD?9403D型紫外分析仪（北京六一仪器厂）；Taq酶（中国大连宝生物有限公司）. 取乙二胺四乙酸抗凝的外周静脉全血1 mL，用DNA提取专业试剂盒（由上海华舜生物工程有限公司）抽提白细胞染色体基因组DNA，-20℃保存备用.

　　1.2  方法

　　1.2.1  引物设计  基因序列来自pubmed资源的基因库，序列号为：X08058，采用网络下载软件Primer 5.0进行引物序列设计，采用美国卫生研究所生物信息中心的BLAST 2.0软件进行引物性能检测，由大连宝生物技术有限公司提供引物合成. Ile105Val位点的上游序列CTCACCCTGTACCAGTCCAAT作为公用引物. 当单核苷酸为A（野生型）时，下游引物为ATAGTTGGTGTAGATGAGGGAGAT；当单核苷酸为G（变异型）时，下游引物为ATAGTTGGTGTAGATGAGGGAGAC. Ala114Val位点的下游序列ACCCTCACTGTTTCCCGTTGC作为公用引物. 当单核苷酸为C（野生型）时，上游引物为GGTGGTGTCTGGCAGGAGGC；当单核苷酸为T（变异型）时，上游引物为GGTGGTGTCTGGCAGGAGGT. Asp147Tyr位点的下游序列CCTCACTGTTTCCCGTTGC作为公用引物，当单核苷酸为G（野生型）时，上游引物为CAAGACCTTCATTGTGGGAG；当单核苷酸为T（变异型）时，上游引物为CAAGACCTTCATTGTGGGAT.

　　1.2.2  PCR反应体系  Taq酶0.2 μL，10×Ex buffer 3 μL, MgCl2 2 μL, dNTP 2 μL, 上游、下游引物分别1 μL, 模板DNA 3 μL, 加水至25 μL. Ile105Val 位点的循环体条件为94℃ 3 min预变性一个循环，94℃ 30 s变性，61℃ 30 s退火，72℃ 1 min延伸，共35个循环，最后72℃ 10 min延伸1个循环. Ala114Val位点的循环体条件为94℃ 3 min预变性1个循环，94℃ 30 s变性，64℃ 30 s退火，72℃ 1 min延伸，共35个循环；72℃ 10 min延伸1个循环. Asp147 Tyr位点的循环体条件为94℃ 3 min预变性1个循环，94℃ 30 s变性，57℃ 30 s退火，72℃ 1 min延伸，共35个循环，72℃ 10 min延伸1个循环.

　　1.2.3  SNPs的检测  采用单一等位基因特异性引物PCR技术(single allele?specific primer, SASP?PCR)对GAT?Pi基因的SNPs分别进行野生型和变异型检测［6］.
   
　　统计学处理：应用SPSS 15. 0 统计软件包处理数据. 所用统计分析方法为χ2检验.

　　2  结果
   
　　癫痫组与正常对照组的年龄及性别比较，差异无统计学意义(P>0.05).

　　2.1  ASP?PCR技术测定的GST?Pi 3位点的基因型  等位基因特异性引物?PCR(ASP?PCR)技术测定的GST?Pi基因3位点(Ile105Val，Ala114Val和Asp147Tyr)的SNP 3种基因型，其中图1 为Ile 105 Val的3种基因型AA，AG和GG，PCR长度为512 bp；图2为Ala114Val的3种基因型CT，TT和CC，PCR长度为493 bp；图3为Asp147Tyr的3种基因型GG，GT和TT，PCR长度为393 bp.

　　M： 50 bp DNA marker，内参位在193 bp ； 1～2： Ile/Ile（AA野生型纯合子）； 3～4： Ile/Val(AG杂合子)； 5～6： Val/Val(GG变异型纯合子).

　　图1  GST?Pi 基因3位点Ile105Val的3种基因型（略）

　　M： 50 bp DNA marker，内参位在193 bp； 1～2：Ala/Val (CT杂合子)； 3～4：Val/Val(TT变异型纯合子)；5～6： Ala /Ala (CC野生型纯合子).

　　图2  GST?Pi 基因3位点Ala114Val的3种基因型（略）

　　2.2  单个位点基因型分布  正常对照组与癫痫组单个位点基因型分布见表1. 两组间单个位点基因型构成差异具有统计学意义（P<0.0001，Ile105Val：χ2=63.29，Ala114Val：χ2=87.77，Asp147Tyr：χ2=79.49）；组内不同性别间差异无统计学意义(P>0.05，校正χ2检验). 难治性癫痫组与非难治性癫痫组单个位点基因型分布见表2. 两组间单个位点基因型构成差异无统计学意义(P>0.05, 校正χ2检验). 组间及组内不同性别间差异均无统计学意义(P>0.05，校正χ2检验).

　　M： 50 bp DNA marker，内参位在193 bp ； 1～2： Asp/Asp(GG野生型纯合子)； 3～4： Asp/Tyr(GT杂合子)； 5～6： Tyr/Tyr(TT变异型纯合子).

　　图3  GST?Pi 基因3位点Asp147Tyr的3种基因型（略）

　　表1  癫痫组与正常对照组GST?Pi 3位点基因型分布频率（略）

　　2.3  组合基因分布  正常对照组中无位点突变19例，1个位点突变14例，两个位点突变10例，3个突变3例；而癫痫组依次为0，4，20和68例，两组比较差异具有统计学意义(P<0.0001, χ2=79.02). 3个位点均突变的比例癫痫组显著高于正常对照组（表3）. 难治性癫痫组中无位点突变0例，1个位点突变3例，2个位点突变13例，3个位点突变27例；非难治性癫痫组依次为0，1，7和41例，两组差异具有统计学意义（P<0.05，χ2=5.18），3个位点都突变的患者比例难治性癫痫组显著低于非难治性癫痫组（表4）.

　　表2  难治性癫痫组与非难治性癫痫组GST?Pi 3位点基因型分布频率（略）

　　表3  对照组与癫痫组GST?Pi 3位点组合基因的分布频率（略）

　　注：＊为1个位点变异；＊＊为2个位点变异；＊＊＊为3个位点均变异.

　　表4  难治性癫痫组与非难治癫痫组GST?Pi组合基因的分布（略）

　　注：＊为1个位点变异；＊＊为2个位点变异；＊＊＊为3个位点均变异.

　　3  讨论
   
　　我们发现GST?Pi基因突变尤其是多个位点基因突变与癫痫易感性相关，说明GST?Pi基因突变可能参与了癫痫的发病. 推测其机制可能与GST?Pi的C端功能相关. 有研究［7］报道未变异的GST?Pi基因C端功能正常，表达的GST?Pi蛋白能与c?Jun氨基末端激酶（JNK）的结合而抑制JNK活性，从而对细胞凋亡、增殖、分化、应激进行调节［8-10］. 而基因变异可能引起GST?Pi的C端不能发挥正常功能进而引起凋亡、增殖、分化、应激功能的紊乱，所以可能在某些诱因下易发癫痫.
   
　　本研究还发现GST?Pi 基因单个位点变异对癫痫是否成难治性不相关，但多个位点变异特别是3个位点均变异的人群不易发展成为难治性癫痫. 推测其机制可能是GST?Pi基因的多个位点突变影响了其N端功能. 未变异的GST?Pi基因N端表达GST?Pi蛋白，具有催化还原型谷胱甘肽与亲脂性抗癫痫药物结合，从而将抗癫药还原成亲水物质排出体外的功能，如肖争等［11］及彭佑群等［12］研究所示GST?Pi蛋白表达增高会导致难治性癫痫的发生. 而基因多个位点变异可能导致GST?Pi的N端不能发挥正常功能，不能表达正常的GST?Pi蛋白，不能通过催化还原型谷胱甘肽与亲脂性抗癫痫药物结合，进而不会将抗癫药还原成亲水物质排出体外，不易发展成耐药性癫痫. 该发现从另一个角度也支持关于GST?Pi是耐药基因的学说［11-12］. 本实验对GST?Pi基因的初步研究为癫痫的发病机制提供一点新思考. 该基因究竟如何参与癫痫发生、规避癫痫难治的确切机制尚需进一步研究.

【】
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　　［4］ No authors listed. Proposal for revised clinical and electroencephalographic classification of epileptic seizures. From the Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy［J］. Epilepsia, 1981, 22(4): 489-501.

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