促性腺激素释放激素对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响

           作者：曹宏伟, 蒲若蕾, 黄威权, 姚兵, 陈蕾, 张荣庆, 姬秋和 

【摘要】  目的： 通过观察GnRH类似物（GnRHR激动剂和拮抗剂）对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响，了解cAMP在GnRHR介导的信号转导通路中的作用. 方法： 以不同浓度GnRH类似物对原代培养的大鼠胰腺细胞进行刺激，借助放免法测定观察在体外条件下GnRH类似物对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响. 结果： 在量效实验中，各浓度GnRHR激动剂均能使细胞内cAMP含量增加，其中10-8～10-5mol/L中4个浓度组最为明显，与对照组相比有非常显著差异（P<0.01）. 应用GnRHR拮抗剂（10-6mol/L）后明显抑制了激动剂组增高cAMP含量的作用，其cAMP水平与对照组比较没有显著差异（P>0.05）. 在时效实验中，应用10-7mol/L GnRHR激动剂刺激细胞，从10 min起细胞内cAMP含量即开始增多，到1 h达到峰值，以后逐渐下降，8 h后恢复到原水平. 结论： 由以上结果推测cAMP可能是GnRHR 介导的信号转导通路中的信号分子之一.

【关键词】  大鼠；胰腺；促性腺激素释放激素受体；信号转导；环磷酸腺苷

　　【Abstract】 AIM: To observe the effects of stimulators and blockers of gonadotropin releasing hormone (GnRH) receptors on cAMP production by rat pancreatic cells in vitro. METHODS: Cell culture and radioimmunoassay were used to investigate the changes of cAMP production in culture media supplemented with different concentrations of GnRH analogues.RESULTS: The GnRH agonist could stimulate cAMP production in a concentration?dependent manner from 10-8  to 10-5 mol/L, which was blocked by the GnRH antagonist(10-6 mol/L，P<0.01).The cAMP production could be stimulated by the GnRH agonist(10-6 mol/L) in a time?dependent manner, which reached its peak at 1 h after the stimulation and returned to its original level at 8 h later. CONCLUSION： cAMP may be one of the signaling factors involved in the GnRH receptor?s signaling pathway.

　　【Keywords】 rat；pancreas；gonadotropin releasing hormone receptor(GnRHR）；signaling pathway；cAMP

　　0  引言
   
　　我们以往的研究发现，GnRH及其受体在大鼠胰腺上皮细胞均有表达［1-5］，同时功能实验证实GnRH可以影响胰腺的内、外分泌功能. 那么GnRHR作为胰腺细胞膜上的特异性受体，是如何将胞外刺激信号传至胞内？其信号转导通路都有哪些信号分子的参与？这些问题的研究对于深入了解GnRH对胰腺作用的分子机制具有重要意义. 本研究拟通过观察GnRH类似物对大鼠胰腺细胞内cAMP含量的影响，了解cAMP在GnRH受体介导的信号转导通路中的作用.

　　1  材料和方法

　　1.1   材料  RPM1640培养基，胎牛血清（FCS），胰酶（Hyclone公司）；链霉素，青霉素（清华大学校）；GnRH agonist （［D?Trp6］?LH?RH）， GnRH antagonist（D?Phe2，D?Ala6］?LH?RH），胶原酶Ⅰ，BSA（Sigma公司）；cAMP放免检测试剂盒（北京原子能研究院同位素研究所）；当日生同窝SD大鼠（北京维科利华实验动物中心）.

　　1.2   方法

　　1.2.1  大鼠胰腺腺泡细胞的原代培养  将等体积胰酶与胶原酶混合成细胞分离液，预热至37℃待用. 乳鼠行颈椎脱臼法处死，75 mL/L酒精溶液中消毒3～5 min，移入超净台，剖腹，无菌条件下取胰腺组织，放入4℃ Hanks液中；小心去除被膜及脂肪组织，用弯头眼科剪将其剪成1 mm3左右的碎块；将5 mL预热的细胞分离液移入25 mL锥形瓶中，37℃下消化15 min（其间摇动数次）；待大块组织沉降后，40 μm 筛网过滤. 用新鲜的细胞分离液重复以上步骤2次，收集滤液，离心后重新悬浮于10 mL Hanks液中. 在另外两个离心管中加入35 mL BSA，每管溶液上轻轻移入5 mL 细胞悬液，100 g离心5 min，弃上清. 重复以上步骤两次. 悬浮细胞于1640培养液中，接种于25 cm2 培养瓶，放入体积分数50 mL/L CO2，37℃ 培养箱内培养30 min，把培养液倒入另一培养瓶，其中即为较纯的上皮样细胞；隔日换液，利用时差贴壁法进行纯化，直至成纤维样细胞被去除.

　　1.2.2  细胞分组施加刺激因素  纯化的胰腺腺泡细胞生长状态稳定后，消化分离记数细胞，接种于24孔板；待细胞生长满至孔底时（24 h），更换含20 mL/L 血清的培养液使细胞同步化；不同药物浓度（剂量效应）刺激：分别给予各孔内加入10-9，10-8，10-7，10-6 ，10-5 GnRH agonist，10-7 GnRH agonist +10-6 GnRH antagonist，孔内不加药物作为对照组；不同药物作用时间（时间效应）刺激（药物浓度：10-7 GnRH agonist）：分别给予 0，5，10，30，60 min，2，4，8，24 h作用时间.

　　1.2.3  检测样品制备  分别按量效和时效实验分组孵育细胞后，吸去药液终止实验；加入冷TE缓冲液冲洗细胞，然后用细胞刮子刮下细胞，分别收集到玻璃试管中，按分组标记好；每管加入1 mL TE缓冲液，吹散细胞，100℃水浴5 min；冰上冷却；4℃ 3000 g 离心15 min，取上清标于Ep管标记待测.

　　1.2.4  cAMP活性检测  (1) cAMP标准液配制：取试剂盒中标准cAMP 1瓶（内含cAMP 320 pmol），加TE缓冲液800 μL溶解成400 pmol/L溶液A，然后稀释如下：取小试管6只，每管加0.4 mL TE缓冲液；第1管加入0.4 mL 溶液A，得到200 pmol/ L 溶液B；依次将上一管溶液0.4 mL 加入后一管中，得一系列标准液：40 μL溶液中cAMP浓度分别为400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 pmol/L. （2）cAMP测定（整个反应在冰浴中进行）：将0.8 cm×6 cm小试管编号后入冰浴中，反应液总体为130 μL；按预先确定从左向右依次加入试剂；加入结合蛋白后摇匀；冰浴2小时；除CT管外，每管加入50 μL吸附剂，摇匀，立即1000 g离心6 min；吸上清120 μL，置测量瓶中，加1.5 mL无水乙醇；加闪烁液，盖严，摇匀；液闪仪上记数测量，单位为pmol/L. 经过换算，结果数值应为pmol/105 cells的倍数.
    
　　统计学处理：数据以x±s表示，应用SPSS 11.0统计软件对组间比较进行单因素方差分析. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2  结果

　　2.1  GnRH类似物对胞内cAMP水平的影响  在量效实验中，应用不同浓度的GnRHR激动剂（10-9～10-5 mol/L）刺激细胞，时间为1 h. 结果表明，各浓度GnRHR激动剂均能使细胞内cAMP含量增加，其中10-8～10-5 mol/L间4个浓度组最为明显，与对照组相比差异非常显著（P<0.01）. 应用GnRHR拮抗剂（10-6 mol/L）后明显抑制了激动剂组增高cAMP含量的作用，其cAMP水平与对照组比较无显著差异（P>0.05，图1）. 在时效实验中，应用10-7  mol/L GnRHR激动剂刺激细胞，结果发现，从10 min起细胞内cAMP含量即开始增多，到1 h达到峰值，以后逐渐下降，8 h后恢复到原来水平（图2）.
 
　　aP<0.05 vs 对照，bP<0.01 vs 对照.

　　图1  不同浓度GnRH类似物对胞内cAMP的影响（略）

　　图2  不同作用时间GnRH类似物对胞内cAMP的影响（略）

　　3  讨论
   
　　通过对经典的GnRHR介导的信号转导通路的研究人们发现，GnRH与细胞膜上的特异受体结合后，通过结合多种G蛋白（Gq/11，Gs和Gi/o）激活多条信号通路，如Ca2+, cAMP和MAPK通路中［8-10］受体与胞外配基结合激活了G蛋白，活化的G蛋白可分为两部分，即α亚基呈激活态，并与βγ二聚体脱离. 这一过程可激活腺苷酸环化酶产生第二信使cAMP，同时还可激活磷脂酶C（PLC），激活的PLC可分解膜磷脂成分PIP2产生IP3和DG，二者数量的增加进一步激活蛋白激酶C（PKC），同时提高胞内Ca2+的水平. PKC和Ca2+分别介导不同的细胞功能，其中PKC需要进一步激活下游的MAPK，而Ca2+则可以直接诱导细胞功能的变化［6］.
   
　　随着研究的，垂体外表达的GnRHR被逐渐发现，有趣的是越来越多的研究发现，GnRHR可以介导多条信号转导通路，其信号转导机制可因组织、细胞、细胞系培养条件不同而异. 例如同是原代培养的大鼠垂体细胞，就被报道分别有PKC/Ca2+，PKC，MAPK，Ca2+4种信号转导机制［8-9，11］，而同是小鼠αT3?1细胞系（特异表达GnRHR）， 也被报道分别有PKC/Ca2+，PKC，MAPK，Ca2+四种信号转导机制［10，12-13］. 同种细胞中多条信号通路的发现，使人们推测其信号通路间存在cross?talk的相互影响机制［10-14］.
   
　　我们先前的研究表明，GnRH及其受体在大鼠胰腺均有表达，同时功能实验证实GnRH对胰腺的分泌功能具有调节作用［4］. 为了进一步研究大鼠胰腺腺泡细胞GnRHR的信号转导机制，我们对经过GnRH刺激的大鼠胰腺细胞内信号分子cAMP变化情况进行了研究. 有研究认为，胞内cAMP水平的提高与细胞生物合成作用有关，而与细胞的快速性激素释放无关［15］. 我们的研究发现，GnRH类似物刺激胰腺细胞后，cAMP水平明显升高，在0～1 h 变化最大，1 h 达高峰，随后逐渐下降. 说明cAMP也参与了GnRHR的信号转导通路，但是它的参与介导了胰腺细胞的何种功能尚需进一步的研究来揭示.

【】
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