方剂药效物质基础研究新方法: “药效差示血清色谱法”

            作者：乔逸，文爱东，杨志福，肖芬    

【摘要】  中药化研究是促进中医药国际化进程的重要途径,制约中药现代化研究的瓶颈之一是方剂药效物质基础研究. 迄今仍然没有一个方剂、甚至没有一味中药能被阐明药效物质基础，阻碍方剂药效物质研究的关键问题在于缺乏行之有效的研究策略和方法，我们在前人研究基础上提出方剂药效物质基础研究新观点，即“药效差示血清色谱法”，在此方法的指导下研究方剂药效物质基础，希望药效差示血清色谱法的应用能进一步阐明药效物质基础，对中医药现代化及天然药物的研究有所裨益.

【关键词】  方剂；药效物质基础

　　0  引言
   
　　方剂药效物质基础研究是以药物化学与药为基础，分析方剂有效部位及有效成份,建立对其质量控制的方法和标准；并且为提示中药复方配伍、优化处方组成、改进制剂工艺、提高质控标准提供依据，为阐明中药及其复方的作用机制和代谢过程奠定基础. 方剂药效物质基础研究目的是以实现开发具有自主知识产权的创新中药新药、促进中药临床疗效为新靶标,为推动中药现代化、国际化进程奠定基础. 现对已取得研究进展的思路、方法及学说进行论述,并在此基础上提出研究药效物质的新思路：“药效差示血清色谱法”.

　　1  取得一定进展的方剂药效物质基础研究思路和学说

　　1.1  方剂整体研究   罗国安［1］提出中药方剂药效物质基础的研究应采用“一个结合、两个基本讲清、三个化学层次、四个药理水平”的理论研究体系. 结合现代方法和先进的分析仪器阐明中药作用的物质基础. 具体方法是将中药方剂作为一个研究整体，采用现代分离技术，分离性质相近的化合物群(如皂甙类、黄酮类、生物碱类等)，这些化合物群即有效部分，是方剂所有药物含某类化合物的总合. 刘建勋等［2］研究认为中药复方的物质基础是中医证与病相结合的有效成分，其研究思路是在中医药理论与现代医药理论的共同指导下，以临床疗效为基础，建立动物、器官和细胞模型深入研究，最终阐明中药的药效物质基础. 目前对单味中药的物质基础尚不明确，故复方研究较为缓慢.

　　1.2  方剂的拆方研究  方剂拆方研究目的在于精简方剂、寻找发挥增效减毒作用的最佳药物组合及确定方剂中主要药物或活性物质来源. 刘永刚等［3］对麻黄汤进行拆方研究，考察各配伍对嗜酸性粒细胞和肥大细胞的抑制作用，采用体外实验观察致敏小鼠抗原攻击后肺灌洗液（BALF）和外周血中的嗜酸性粒细胞聚集反应，采用离体试验观察致敏大鼠抗原攻击后腹腔肥大细胞脱颗粒反应. 结果显示： 麻黄汤及拆方减少BALF和外周血嗜酸性粒细胞的浸润不完全相同；麻黄汤及拆方也不同程度抑制致敏大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒反应. 说明麻黄汤对嗜酸性粒细胞和肥大细胞具有抑制作用，拆方分析显示麻黄汤全方效果最佳. 给大鼠腹腔注射糖原诱导中性粒细胞聚集，分离中性粒细胞，以花生四烯酸、实电解质钙刺激离体中性粒细胞释放白三烯，再用HPLC法测定中性粒细胞中白三烯量，并以二甲苯致小鼠耳肿胀研究麻黄汤及拆方的抗炎作用. 结果发现： 麻黄汤及拆方不同程度抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和中性粒细胞释放白三烯. 拆方分析显示麻黄汤全方效果最佳，初步验证组方的科学性和合理性［4］. 拆方可以验证方剂配伍的一定合理性及优缺点，优化组方，为寻找真正的药效物质提供相应依据.

　　1.3  方剂有效部位药效物质研究  方剂由多味中药组成，即有多种药用部位，一种有效部位中有多种药用成分，同样可以利用各种现代筛选模型和筛选技术，发现2～3种不同作用的有效部位和每种有效部位中的2～3种有效成分. 以此为基础，可以进一步在有效部位和有效成分2个层次上以一种药理作用为主要因素，研究部位间或成分间或部位与成分间的相互促进或相互抑制的协同关系，初步阐明现代中药不同与西药而发挥综合作用的机制［5］. 黄兆胜等［6-7］用极性由小到大的4种有机溶剂依次萃取当归补血汤水煎液，所得各部位给饥饿性气虚模型小鼠灌胃，以T淋巴细胞百分数为指标，探讨发挥益气功效的有效部位；给急性失血性血虚模型小鼠灌胃，以Hb为指标，探讨发挥补血功效的有效部位. 结果证明全方益气的药效物质基础主要存在正丁醇与水层的极性区间，可能主要是黄芪多糖、苷类及当归水溶性物质；补血药效物质基础主要存在于正丁醇与醋酸乙酯的极性区间，可能主要是黄芪的苷类、苷元及当归的酚性物质等. 此方法揭示了一些中药的药用部位，药效物质研究尚处于探索之中.

　　1.4  中药血清药理学及血清药物化学研究  中药血清药理学主要针对中药及其复方复杂多样的化学成分特点，用含药血清代替煎剂或粗提物进行体外实验研究药效物质基础. 莫红缨等［8］采用中药血清药理学研究方法，观察含双黄连及其拆方的大鼠血清对抗呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用. 结果显示双黄连复方具有明显抗RSV的作用，并优与各拆方；复方及拆方的体外和血清药效学结果具有一定的相关性. 可知双黄连组方合理，并具有多环节抗RSV的作用. 血清药物化学主要是发现并观测血清中外源性生物活性物质以及这些物质的作用和代谢规律. 王喜军等［9-10］建立了六味地黄丸及其大鼠口服(po)后在血清中的HPLC指纹色谱，分析比较六味地黄丸、缺味处方、单味生药以及各组分给药后所得血清样品，鉴定po六味地黄丸后大鼠血中移行成分、来源生药及其代谢产物. 结果显示po六味地黄丸后从血中发现了11个入血成分，其中4个为新产生的代谢产物；7个成分为六味地黄丸所含成分的原型，其中有一成分虽为地黄中所含成分的原型，但其他两种药材也能代谢产生，对其体内的量变有共同的贡献，在此基础上成功分离8个化合物,并对其结构进行了鉴定,这些都将有助于阐明六味地黄丸的有效成分及作用机制. 血清药理学与血清药物化学是日本学者20世纪提出的方法，对于研究药效物质有积极意义，对于我们提出新的研究方法起到抛砖引玉的作用.
　　
　　1.5  中药“药效团药性假说”  李爱秀［11］在李石生等人的中药“分子药性假说”基础上提出“药效团药性假说”，主要论点是： ①分子具有药效，其药性是有规律的. 药物分子的药性蕴含在药物分子的特定结构中，“特定结构”指药物分子与某个受体产生相互作用时所具有的“药效团”；②中药所含有效成分具有分子多样性和药效团多样性特点. “分子多样性”指中药中所含化学成分的多样性，众多化学成分中作用相近或相同的分子具有相同的药效团，作用不同的分子具有不同的药效团，分子多样性是产生药效团多样性的前提；③中药药性多样性及其多靶点作用机制. 中药有效成分所含药效团的多样性，决定了中药对肌体作用的多靶点作用机制. 中药“药效团药性假说”的意义在于从分子水平上揭示中药药效物质基础产生疗效的作用机制.

　　1.6  “分子中药组学”  马增春等［12］提出“分子中药组学”学说，认为中药复方是通过化学成分组合影响信号分子组合，使紊乱的信号分子恢复平衡，从而起到治疗中医的“证”和相关疾病的作用和效果. 研究路线从构建证候本质图谱“证候?作用通路?信号分子?分子网络”出发，考察中药复方、作用部位、有效成分、成分组合等不同水平对证候本质图谱的影响. 分子中药组学是从分子水平上研究中药疗效的物质基础和作用原理，使传统中药从宏观认识向微观世界接近. 李鹰飞等［13］应用“分子中药组学”策略研究四物汤，结果发现: 四物汤补血的物质基础是多糖、川芎嗪、阿魏酸和芍药苷，补血作用的分子机制是影响造血相关细胞因子的表达. 此种方法有一定成效，但对于中医证候信号分子认识目前尚没有明确定论，而用“分子中药组学”来探讨中医机体的证候，从而确定药效物质还处于初步研究阶段.

　　1.7  方剂组织药理学新假说及方剂代谢物组学新假说  唐文富等［14-15］方剂组织药理学以期阐明病变靶组织内不同中药或方剂的主要成分谱及其浓度与靶组织病理形态学和疗效的关系；方剂代谢物组学是在运用代谢物组学理论的整体性特点和系统性思想,以中药方剂的治疗机制、作用靶点、疗效标准、药效和毒性模型的鉴别和确证、疗效和毒性的化学或生物标志物的科学. 方剂组织药理学和方剂代谢物组学是以中医理论为指导，运用药理学方法研究中药(方剂)有效成分对病变靶组织的影响及其作用原理的科学. 运用HPLC， LC?MS?MS和NMR等分析方法研究不同中药方剂在不同疾病病变组织内的成分谱、浓度变化、作用位点或受体、有效成分与组织的相互作用及量效关系，以阐明中药方剂作用的物质基础和过程，寻找中药归经理论的客观证据. 上述方法对于我们提出的新方法有一定启后作用.

　　2  方剂药效物质基础研究的新方法： “药效差示血清色谱法”
   
　　以上论述了方剂药效物质基础研究的思路、方法及学说，主要有： 以方剂全方、拆方来研究有效成分或有效部位的方法；“药效团药性假说”、“分子中药组学”、血清药及血清药物化学、方剂组织药理学新假说及方剂代谢物组学新假说等方法. 以上方法均能从有效部位、药效团等方面揭示一定的方剂药效物质，对于进一步研究中药复方和天然药物药效物质有很大的促进作用. 我们在借鉴以上多种方法的优点以及对国内外大量追踪和检索的基础上，结合十几年中药药动学研究经验提出全新研究方法: “药效差示血清色谱法”. 我们认为当中药在对证机体内产生药效变化时，机体血清中化学组分数相应的变化差中必定最小范围而最大程度的包含着真正的药效物质基础. 该策略首先借助色谱法建立中药对证产生最大药效和最小药效时血清中的化学组份物质谱，然后以差示的方法表达且初步分离出该组方的体内药效物质，并将分离产物用于对证模型，以药效验证结果反馈性调整差示色谱条件，直至确认药效物质；最后结合质谱及核磁共振波谱动态定性、定量中药体内药效物质的变化，并与相应的药效结合研究，进一步确认中药的药效物质基础. 此方法是借助血瘀证模型基础上，以红花为工具药，以缓解心肌缺血、改善冠脉血流等指标为药效,以红花在对证机体产生最大和最小药效时血清中物质谱的变化差为导向，以色谱、波谱等方法追踪分离和鉴定红花的药效物质. 提出“药效差示血清色谱法”的意义在于以红花研究为基础，以实现中药化为目标，利用现代药理、药化、分析等多种新知识、新理论，从研究机体血清化学组分数相应变化差中，寻找药效物质基础，从而为真正揭示方剂药效物质基础研究开创了一个全新局面，为研究创新中药、中药国际化进程奠定基础.

　　3  展望
     
　　方剂药效物质基础研究一项非常复杂且庞大的工程,涉及中药、药理学、数学、分子生物学等多学科的交叉和融合. 相信只要中医药科研工作者齐心协力、相互配合,将中药药效物质基础研究与中医理论研究相结以实现中药现代化为目标，应用“药效差示血清色谱法”的方法，利用现代药理、药化、分析等多种新知识、新理论，从研究机体血清化学组分数相应变化差中，寻找药效物质基础，从而为真正揭示中药和天然药物药效物质基础研究开创了一个全新局面，能够开发出一批能控制或治愈当今世界上重大疑难病证的新药,让中药真正走向世界,为全人类的健康作出贡献.

【文献】
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