CGRP和NGF对全脑缺血再灌注大鼠脑组织PKB表达的调节作用

【摘要】  研究大鼠脑缺血再灌注后蛋白激酶B（protein kinaseB, PKB）的表达，探讨降钙素基因相关肽（CGRP）和神经生长因子（NGF）对脑组织缺血再灌注的保护作用及机制。方法：根据Nagasawa线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,采用电镜、免疫组织化学SABC法及显微图像分析检测海马及皮质内PKB的表达。结果：大鼠缺血再灌注海马及顶叶皮质内PKB反应产物较正常组增多(P<0.05),而注射CGRP或NGF后阳性产物明显高于缺血再灌注组(P<0.01),二者联合应用效果更加显著(P<0.05)。结论：CGRP及NGF参与缺血神经元PKB的调节,二者对缺血神经元有协同修复作用。

【关键词】  蛋白激酶 神经生长因子

　　ＡｂｓｔｒａｅｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：To investigate the expression of protein kinase B(PKB) in hippocampusafter regional cerebral ischemia and reperfusion in rats, explore the protective effects and mechanism of calcitonin and gene?related peptide(CGRP) and nerve growth factor(NGF) on brain tissue.Methods：An novel model of regional cerebral ischemia and reperfusion induced by middle cerebral artery occluded (MCAO)in rats was mode．The expression of PKB in hippocampus and cortex was detected with electron microscope,SABC immunohistochemical method and analyzed by microimage system. Results：The expression of PKB in hippocampus and cortex was increased after cerebral ischemia and reperfusion(P<0.05)．Ｃompared with this, the percentage of PKB immunoreaction positive cells in CGRP or NGF group were higher (P<0.01)．The combined usage of CGRP and NGF enhanced such effects(P<0.05).Conclusion：The results indicate that CGRP and NGF participate in the regulation of expression of PKB in ischemic neurons,and they may cooperate with each other.

　　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓcalcitonin gene?related peptide; nerve growth factor; protein kinase B; hippocampus; neuron ischemia

    脑缺血导致神经元坏死变性、迟发性神经元死亡和（或）凋亡，其机制十分复杂，至今尚不完全清楚。降钙素基因相关肽（calcitonin gene?related peptide, CGRP）是于1982年第一个利用基因重组技术发现的活性多肽，由37个氨基酸组成，广泛存在于神经组织，具有改善脑血流及神经保护作用[1]。神经生长因子（nerve growth factor, NGF）作为中枢神经系统中最重要的生物活性物质，可控制神经细胞存活的数量和分化，维持成熟神经元的存活，参与受损神经元的修复。此外，NGF可以增强CGRP的表达，刺激CGRP的合成[2,3]。近年来，许多研究表明，蛋白激酶B(proteih Kinase B,PKB)在脑缺血再灌注损害的病理生理机制中可能扮演重要角色[4]。本实验通过检测PKB的表达，来研究CGRP和NGF对脑缺血再灌注的保护作用及其机制。

    1材料与方法

　　1.1脑缺血再灌注模型与分组健康雄性Wistar大鼠30只，体重300～350g，由沈阳医学院实验动物中心提供。分设假手术组、缺血再灌注组、NGF组、CGRP组、NGF与CGRP合用组(N&C组),每组6只大鼠。根据Nagasawa线栓法制作右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，实验大鼠以0.4%戊比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠固定于手术操作台,作颈前正中切口,游离出右侧颈总动脉、颈内、外动脉后结扎颈总动脉和颈外动脉起始部,于颈总动脉分叉部下方剪一小口,将一预先烧成圆头的尼龙线插入颈内动脉,向上至遇到轻微阻力为止(一般线的头端已达大脑中动脉起始部)以栓塞血管。由颈总动脉分叉部起始,其插入的深度平均为(20.5±0.5)mm。栓塞90 min后回抽出线栓约10 mm,恢复再灌注。其它各组分别向颈动脉内注入NGF（500 U/ml，0.5ml）、CGRP（2μg/ml，0.5ml）、CGRP（2μg/ml，0.5ml）和NGF（500U/ml，0.5ml）30min注射完。此后分别于24 h后处死取材。手术过程中常规检测肛温,使肛温保持在(37.0±0.5)℃。大鼠术毕清醒后,观察其行为学变化,按ZeaLonga评分标准将动物的行为变化分为5级:0级,行为无明显变化;1级,左前肢屈曲,左后肢伸展;2级,有左侧追尾现象;3级,行走困难,摇摆不定;4级,意识不清。将1、2、3级动物定为模型成功大鼠,0、4级弃去不用。假手术组仅夹闭右侧颈总、颈外动脉以中断血流90min,术后未见行为异常。用4%多聚甲醛灌注，常规冰冻切片。

　　1.2电镜实验结束后,将各组大鼠断头处死,迅速取出海马,按电镜样品取材要求,3%戊二醛、1%锇酸双固定,常规包埋,光镜选区,制备超薄切片,铀、铅双染,100CX Ⅱ型透射电镜观察。

　　1.3免疫组织化学染色脑的冠状切面冰冻切片，片厚12μm。常规HE染色,光镜下观察假手术组及缺血组的组织学变化，采用免疫组化SABC法检测大脑皮质及海马PKB的表达。多克隆PKB抗体（兔抗大鼠，Santa Cruz,Boster公司代理）以1：100稀释，按SABC试剂盒（Boster公司）说明操作。阳性对照实验磷酸验缓冲液代替一抗进行免疫组化染色。用图像分析仪取每张切片每个部位各测5个相同单位面积的平均灰度值。

　　1.4统计学方法数据采用t检验并进行统计学处理。

    2结果

　　2.1电镜假手术组大鼠海马神经元核比较大、呈圆形或椭圆形,核膜清晰、完整,核质密度低,常染色质多,呈细颗粒状,分布均匀,核仁呈网状,居中;胞质内细胞器丰富,线粒体呈椭圆形或杆状,粗面内质网(RER)散在分布,结构清晰。缺血再灌注组可见核染色较浅,核仁增大且致密,胞质水肿,线粒体肿胀、嵴断裂,基质电子密度增高,粗面内质网脱颗粒;轴突内线粒体空泡样变,髓鞘分层、散乱。神经元胞体水肿,核膜断裂、模糊不清或崩解,异染色质增多,核仁浓密,胞质内线粒体外膜模糊、不连续,嵴断裂、溶解、消失呈空泡化,内质网水肿、扩张、脱颗粒。有的神经元部分核膜清晰,核周隙增宽,部分核膜溶解,染色质呈团块状凝集,核仁碎裂;胞质内细胞器明显减少而致电子密度变低,残存的线粒体崩解呈空泡状,但尚可辨认;内质网减少,神经丝增多,出现细胞凋亡。

　　2.2免疫组化染色及定量分析结果正常组，PKB在顶叶皮质(Brodmann分区第4区)及海马CA1区细胞核内无表达，胞浆内极少表达；I/R组，PKB表达较sham组有所增加（P<0.05）；CGRP组和NGF组，大脑皮质及海马PKB表达较I/R组明显增多（P<0.01）；C&N组，大脑皮质及海马PKB表达较CGRP组和NGF组均明显增多（P<0.05）。各组所测的平均灰度值见表1。表1  各组大鼠海马及皮质PKB蛋白表达平均灰度值（略）注:与sham组比较1) ，P<0.05;与I/R组比较2), P<0.01;分别与CGRP组和NGF组比较3)P<0.05.

　　３  讨论

    越来越多的研究发现，脑缺血再灌注损伤可诱导神经元凋亡[5,6,7]。凋亡发生最显著的部位是缺血周围区（缺血半影区）及缺血敏感区（如海马）等部位。大鼠缺血再灌注30min即可出现细胞凋亡，24～48h凋亡的细胞最多，可一直持续到再灌注28d。脑缺血后神经细胞凋亡发生的机制尚未完全明了，可能与脑缺血再灌注时氧自由基增多、钙超载及兴奋性氨基酸释放有关。研究表明，脑缺血可以激活一些在细胞凋亡过程中起协助作用的基因及其表达产物，通过对促细胞凋亡基因和抑细胞凋亡基因的调控发挥着重要的作用[8]。PKB为分子量大约为60kD的蛋白激酶。PKB能使丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化,故又称为丝氨酸/苏氨酸激酶。PKB能介导多种生物学效应,是重要的抗凋亡调节因子。PKB的激活需要磷酸化苏氨酸308和丝氨酸473位点的氨基酸残基,而此过程依赖于PI3 K的磷脂产物PI?3,4 ?P2和PI?3,4,5?P3。研究发现PI3 K有多种下游效应分子,而PKB被认为是PI3 K的直接的下游作用靶点[9,10]。PI3 K被激活后生成的磷脂产物进一步激活PKB及其下游的信号的级联反应,参与生长、发育、分化和细胞的存活,其中,PI3 K的细胞保护作用越来越引起人们的关注。PI3 K激活的PKB可以介导胰岛素、多种生长因子、凝血酶等诱发的细胞生长,能经多种途径促进细胞存活。

    CGRP对脑组织具有很强的扩张血管、逆转血管痉挛、改善脑血液循环的作用。Weil[11～13]的研究表明，CGRP可改善缺血大鼠的脑血流，推迟海马脑片不可逆缺氧损伤的发生，提高脑片恢复率，降低缺氧所致Ca2+增加，维持细胞内Ca2+稳态；CGRP抑制神经细胞肿胀，细胞膜受损乃至死亡，LDH和钾离子漏出；CGRP抑制缺血时神经细胞caspase?3、c?fos和c?jun的表达。CGRP通过上述机制增加缺血再灌注脑组织皮质及海马PKB蛋白及其下游底物的表达，提示CGRP对缺血神经元具有保护作用。NGF作为中枢神经系统中最重要的生物活性物质，有保护神经元，对抗缺氧、兴奋性氨基酸、自由基和低血糖、细胞内钙超载及一氧化氮损伤的作用，通过低亲和力p75受体和高亲和力trkA受体抑制神经细胞坏死及凋亡的发生，还可促进神经元的生长发育，加速核仁粗面内质网和高尔基氏器形成，维持成熟神经元的存活。NGF抑制缺血时神经细胞caspase?3、c?fos和c?jun的表达[14,15]。此外，NGF可抑制一种71KDaNMDA受体相关mRNA和蛋白的表达，并增加MK?801（一种NMDA受体阻断剂）抗缺血性脑损伤的作用。本实验中，NGF可通过上述机制增加缺血再灌注脑组织皮质及海马PKB蛋白的表达，表明其对缺血神经元同样具有保护作用。

    由于CGRP与NGF有一些相同的作用环节，二者联合应用可能加强神经保护作用。本实验中，CGRP与NGF合用时，大脑皮质及海马PKB蛋白表达较二者单独应用明显增加，表明CGRP与NGF对缺血神经元有协同修复作用。脑缺血再灌注后存在着复杂的病理生理机制，而PKB蛋白表达受多种因素的调控并相互影响，因此CGRP在缺血脑组织上调PKB蛋白表达是直接作用还是通过其它途径的间接作用，以及CGRP和NGF协同作用的确切分子机制需进一步研究。

【】
  　　［１］Bonetti?B, Panzeri?L, Carner?M, et al. Human neoplastic Schwann cells: Changes in the expression of neurotrophins and their lowaffinity receptor p75［Ｊ］. Neuropathol?Appl?Neurobiol,2000，23(5): 380-386．

　　［２］William M，Armstead PhD.Vasopressin?induced protein kinase C dependent superoxide generation contributes to ATP?sensitive potassium channel but not calcium?sensitive potassium channel function impairment after brain injury［Ｊ］.Stroke，2001, 32(6):1408-1414．

　　［３］Renolleau A,Aggoun Z D,Ben A Y,et al.A model of transient unilateral focal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rat:morphological changes　indicative of apoptosis［Ｊ］.Stroke, 2003, 29: 1454-1460．

　　［４］Li Y, Chopp M, Jiang N, et al. Temporal profile of in site DNA fragmentation after transient middle celebral artery occlusion in the rats［Ｊ］. J Cereb Blood Fiow Metab, 2001, 15: 389-395．

　　［５］Li Y, Chopp M, Jiang N, et al. Induction of DNA fragmentation after 10 to 20 minutes of focal cerebral ischemia in rats［Ｊ］.Stroke, 2002, 26: 1252-1257．

　　［６］Takai Y, Kishimoto A, Inoue M, et al. Studies on a cyctic neudotide independent protein kinase and its proenzyme in mammalian tissue［Ｊ］. J Biol Chem，1997, 152: 7603-7609．

　　［７］D?Cruz BJ, Fertig KC, Filiano AJ,et al,Hypothermic reperfusion after cardiac arrest augments brain?derived eurotrophic factor activation［Ｊ］.J Cereb Blood Flow Metab，2002,22(7): 843-８51．

　　［８］Dago L, Bonde C, Peters D,et al. NS 1231, a novel compound with neurotrophic?like effects in vitro and in vivo［J］. J Neurochem，2002,81(1): 17-24．

　　［９］Zhang Y,Widmayer MA,Zhang B,et al.Suppression of post?ischemic induced Fos protein expression by an antisense oligonucleotide to c?fos mRNA lead to increased tissue damage［Ｊ］.Brain Res,1999，832:112-117．

　　［１０］Velier JJ,Ellison JA,Ｋikly KK,et al.Caspase?8 and Caspase?3 are expressed by different populations of cortical neurons undergoing delayed cell death after focal stroke in the rat［Ｊ］．J Neurosci,1999，19:5932-59３4

　　［１１］Waston A,Eiler A,Lallemand D,et al.Phosphorylation of c?jun is necessary for apoptosis induced by survival singnal withdrawal in cerebellar granule neurons［Ｊ］.J Neurosci,2003,18(2)：751．

　　［１２］Kilic E,Kilic U,Soliz J,etal.Brain?derived erythropoiet protects from　focal cerebral ischemia by dual activation of ERK1/2 and Akt pathways［Ｊ］.FASEBJ,2005,19 (14):2026-2028.

　　［１３］Bhat RV, Budd Haeberlein SL, Avila J，et al.Glycogen synthase kinase 3: a drug target for CNS therapies［Ｊ］.J Neurochem，2004，89: 1313-1317.

　　［１４］Calderone A, Jover T, Noh K?M, et al. Ischemic insults derepress the gene silencer REST in neurons destined to die［Ｊ］. J Neurosci,2003,23: 2112-2121．

　　［１５］Chen RW, Qin ZH, Ren M,et al.Regulation of c?Jun N?terminal kinase, p38 kinase and AP?1 DNA binding in cultured brain neurons: roles in glutamate excitotoxicity and lithium neuroprotection［Ｊ］.J Neurochem,2003,84: 566-575.