HSP90β基因突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系
作者：赵艳，王华，陈星云，季业伟，周元国
【关键词】 热休克蛋白90β；糖皮质激素类；突变
【Abstract】 AIM: To screen the mutation of heat shock protein 90β(HSP90β) gene in patients with primary nephrotic syndrome and to investigate the association between the mutation and the sensitivity to glucocorticoid therapy. METHODS: Extract the blood DNA of the 300 glucocoiticoidtreated primary nephrotic syndrome patients. PCR approach was used to amplify intron 9, exon10, intron 10, exon11 and 3 untranslated region of HSP90β, and automated fluorescent sequencing technology was applied to detect the mutation of the region. RESULTS: Two point mutations of HSP90β, 7489 C>T in intron 10 and 7612 C>T in 3 untranslated region were found in primary nephrotic syndrome patients. The mutation frequency of glucocoiticoidsensitive and glucocoiticoidresisted patients were 2.44%， 3.68% and 2.44%， 2.94%; there was no significant difference in the 2 groups(P>0.5). CONCLUSION: This study has found 9 cases of 7489 C>T and 8 cases of 7612 C>T in primary nephrotic syndrome patients ,but there was no significantly difference in the occurrence frequency between glucocoiticoidsensitive and glucocoiticoidresisted groups. The expression quantity of HSP90β has no relation to glucocoiticoid therapeutic effect.
【Keywords】 heat shock proteins 90β; glucocorticoids; mutation
【摘要】 目的： 筛选肾病综合征患者热休克蛋白90β（heat shock protein 90, HSP90）基因突变,并分析该突变与糖皮质激素敏感性的关系. 方法： 提取300例经糖皮质激素治疗的肾病综合征患者血液DNA，采用聚合酶链反应 (polymerase chain reaction)和自动荧光测序方法, 对HSP90基因intron 9， exon10， intron 10， exon11，3非编码区域DNA 序列进行突变分析，结合临床资料探讨突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系. 结果： 在肾病综合征患者中发现了2个HSP90β基因点突变，分别为intron 10的7489 C>T和3非编码区的7612 C>T,其发生频率在糖皮质激素敏感和不敏感患者中分别为（2.44%，3.68%）和（2.44%，2.94%）,两组患者的突变频率无统计学差异(P>0.5). 结论： 在肾病综合征患者中发现9例7489 C>T和8例7612 C>T突变，在敏感和不敏感组的发生频率无显著差异，提示HSP90β表达量与GC治疗敏感性无显著相关.
【关键词】 热休克蛋白90β；糖皮质激素类；突变
0引言
热休克蛋白90（heat shock protein 90, HSP90）是体内普遍存在、高度保守的一类分子伴侣蛋白，是热休克蛋白家族中的重要成员之一，在正常细胞内有较高的组成性表达，约占细胞内蛋白含量的1%~2%［1］，它们参与众多的细胞生理过程. 有人［2］在高加索人中检测到HSP90基因突变，但未作进一步的分析. 因此，HSP90在糖皮质激素糖皮质激素受体（glucocorticoidglucocorticoid receptor, GCGR）信号转导中的作用尤其引起我们的关注. 但目前国内尚无人HSP90基因变异以及与GCGR效应或激素敏感性的相关研究，故本研究旨在筛查肾病综合征患者的HSP90β是否存在突变，并分析该突变与糖皮质激素治疗敏感性的关系，进一步探讨HSP90β在糖皮质激素治疗敏感性差异中的作用，为临床治疗提供理论基础和实践指导.
1对象和方法
1.1对象所收集病例来自第三军医大学新桥和大坪医院，均符合1985年中华全国第二次肾病学术会议制订的肾病综合症诊断标准，治疗方法采用激素治疗标准方法. ① 敏感组： 激素治疗后8 wk内尿蛋白转阴，水肿消退. 164 例患者，其中男79例，女85例，年龄17～66 岁. ② 不敏感组: 治疗8 wk内水肿未消退，或尿蛋白仍“+”以上，136例患者，其中男71例,女65例,年龄22～63 岁. 用EDTANa2 抗凝管抽取清晨空腹静脉血2 mL ,置-20 ℃冻存待检. DNA纯化试剂盒购自Promega公司; Taq 多聚酶购自宝生物公司. 细胞裂解液Ⅰ： 10 mmol/L Tris.Cl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl. 细胞裂解液Ⅱ： 10 mmol/L Tris.Cl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L MgCl2， 0.5 mol/L NaCl, 5 g/L SDS， 2 mmol/L EDTANa2. NP40为Sigma公司产品，酚、氯仿、异戊醇、乙酸钠购自重庆医药股份有限公司. 全自动凝胶成像分析系统（UVP，英国）, PTC100TM PCR 仪 (MJ Research,美国)，全自动基因测序分析仪CEQ8000（BECKMAN COULTER,美国）.
1.2方法
1.2.1基因组DNA 的提取全血DNA的提取采用NP40法. 取500 μL抗凝血于1.5 mL的Eppendorf管,分别加入细胞裂解液Ⅰ和NP40,细胞裂解液Ⅱ裂解后用依次用酚、氯仿抽提，乙酸钠、异戊醇沉淀后可见白色丝状沉淀,乙醇洗涤后溶于TE Buffer，-20℃保存. 用琼脂糖凝胶检查DNA 的完整性及浓度,调整DNA 的浓度至(300~500) ng/μL.
1.2.2引物序列与PCR反应参照Genbank提供的HSP90βDNA序列（Accession No: J04988）和阅读框设计引物,其序列为Sense: 5′ GCCAG CATGG TCTCA AACTC 3′；Antisense: 5′ CATCC AATCC TGCTG TCAAG 3′. 扩增产物为881 bp，扩增区域包括HSP90β基因intron 9,exon10, intron 10, exon11, 3′非编码区域. PCR 反应体系总体积为50 μL. 扩增条件为94℃，5 min, 94℃变性30 s, 60℃退火30 s，72℃延伸1 min , 35个循环后,72℃延伸10 min. 取10 μL加有载样缓冲液的PCR扩增产物加样至15 g/L琼脂糖凝胶中,在电压100 V下电泳30 min后,于全自动凝胶成像分析系统记录结果进行分析.
1.2.3PCR产物的纯化及序列测定PCR 扩增产物的凝胶纯化回收按照Promega公司试剂盒操作说明进行. 纯化回收后使用BECKMAN CEQ8000全自动基因测序分析仪测定产物序列. 统计学处理 糖皮质激素敏感性与HSP90β的等位基因相关性通过优势比OR(Odds Rate) 按公式: OR =ad/bc. 式中a为HSP90β基因有突变的糖皮质激素不敏感的原发性肾病综合征患者；b为HSP90β基因无突变的糖皮质激素不敏感患者；c为HSP90β基因有突变的糖皮质激素敏感的患者；d为HSP90β基因无突变的糖皮质激素敏感的患者. OR的显著性检验按Yates校正公式计算:λ2 = (ad-bc-n/2)2n/(a+b)(c+d)(a+c)(b+d).
2结果
2.1PCR扩增目的片断HSP90β基因PCR产物的琼脂糖电泳图谱，得到的产物长度为881 bp，条带特异，符合预期设结果（图1）.
M：DL2000 Maker，1~4：PCR产物.
图1PCR扩增HSP90β目的基因片段（略）
2.2序列测定在收集的肾病综合征患者中共检测到2个位点突变，分别是HSP90β基因intron 10的7489 C>T和3'非编码区的7612 C>T，其中7489 C>T有9例，7612 C>T有8例. 糖皮质激素治疗敏感和不敏感患者HSP90β基因频率、RR 值及显著性分析显示, 在糖皮质激素敏感患者和不敏感患者中该位点基因突变的频率分别为（2.44%，3.68%）, 突变位点多态性分布无统计学差异(P>0.6). HSP90β基因3'非编码区存在7612 C>T突变, 在糖皮质激素敏感患者和不敏感患者中该位点基因突变的频率分别为（2.44%，2.94%）, 突变位点多态性分布无统计学差异(P>0.5，表1).
表1HSP90β基因7489,7612位点基因型分布及等位基因频率分析（略）
3讨论
自1962年Ritosa发现热休克反应后，热休克蛋白的研究引起了人们广泛的关注. HSP90β通过改变糖皮质激素受体的立体结构使之产生特定的生物学效应［3-4］. 而HSP90作为GCGR效应通路中的重要分子伴侣，其结构和数量的变化都将影响GCGR效应的发挥.
以往多数研究者从GR的基因多态性方面进行研究，并证明多种自身免疫性疾病GR自身结构的变化对GCGR效应有显著的影响［5-6］，但是仅少数可检测到GR基因变异. Koper等［7］在正常人群中也发现GR 基因结构异常的个体,他们临床上均无明显症状,因此这一说法尚不能完全解释GCGR效应差异的问题. Bohen等［8］在研究GR功能时发现酿酒酵母HSP82(与人HSP90相对应)突变体中GR的活性明显下降. 我室之前的研究发现同系不同株的小鼠BALB/C和C57BL/6的HSP84 中存在4个有意义突变，并且两种小鼠在应激时的死亡率、GR的核转位效应都存在显著差异. 因此本实验收集了300例经GC治疗的肾病综合征患者，检测是否存在HSP90β基因变异，并进一步分析HSP90β基因变异与激素治疗敏感性的关系. 通过对人HSP90β基因结构和在小鼠中已发现的4个有意义突变位点的分析，本研究确定检测的区域包括HSP90β的二聚化和GR结合域两个重要功能域. HSP90基因GR结合域的基因变异可以影响GCGR复合物的形成，同时其二聚化位点的基因变异引起HSP90蛋白二聚体构象发生变化，形成不稳定且不利于GC结合的GR复合物，或者结合GC后不能充分暴露出核定位信号（nuclear localization signal, NLS），减少GR的核转位，进而减少受GR调控的脂皮素、IL1、NOS等炎症因子的转录，达到减轻炎症的效果，从而影响GC治疗敏感性.
在本实验研究的164例激素敏感患者和136例激素不敏感患者中，肾病综合征患者HSP90β基因7489 C>T，7612 C>T基因突变在GC治疗敏感和不敏感患者中的基因频率无统计学差异(P>0.5)，提示在原发性肾病综合征患者中GC治疗敏感性与HSP90β基因7489, 7612位点突变无关. 由于已发现的突变均位于非翻译区，其变化只影响HSP90β的表达量，而表达量的变化对肾病综合征GC治疗敏感性无关，我们推测HSP90β是通过结构的差异影响GCGR效应，但差异来自HSP90β基因表达区的何处突变目前还缺少证据，尚需进一步实验证明.
【】
［1］Chen B, Zhong DB, Monteiro A. Comparative genomics and evolution of the HSP90 family of genes across all kingdoms of organisms ［J］. BMC Genomics, 2006,7:156.
［2］ Passarino G, Gianpiero LC, Stecconi R, et al. Molecular Variation of Human HSP90a and HSP90b Genes in Caucasians ［J］. Human Mutation, 2003,21(5):554-555.
［3］Kanelakis KC, Pratt WB. Regulation of glucocorticoid receptor ligandbinding activity by the HSP90/hsp70based chaperone machinery ［J］. Methods Enzymol, 2003,364:159-173.
［4］Pearl LH, Prodromou C. Structure and in vivo function of Hsp90 ［J］. Curre Opinion Struct Biol, 2000,10:46-51.
［5］Koyano S, Saito Y, Nagano M, et al. Functional analysis of three genetic polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene ［J］. J Pharmacol Exp Ther, 2003,307(1):110-116.
［6］Lauten M, Beger C, Gerdes K, et al. Expression of heatshock protein 90 in glucocorticoidsensitive andresistant childhood acute lymphoblastic leukaemia ［J］. Leukemia, 2003,17(8):1551-1156.
［7］Koper JW, Stolk RP, Lange R, et al. Lake of association between five polymorphisms in the human glucocorticoid receptor gene and glucocorticoid resistance ［J］. Hum Genet, 1997,99:663-668.
［8］Bohen SP, Yamamoto KR. Isolation of Hsp90 mutations by screening for decreased steroid receptor function ［J］. Genetics, 1993,90:11424-11428.
