庆大霉素耳中毒后不同时间耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系

【摘要】  观察庆大霉素（GM）耳中毒后不同时间豚鼠耳蜗血管纹热休克蛋白70（HSP70）表达与ABR的关系。方法：选用健康白色红目豚鼠100只，体重200～250g，随机分为：生理盐水组、GM组，各组皆连续用药10d。各组动物混合饲养，每日测量体重调整药量。在用药前和停药后1、3、7、14、30d分别检测ABR阈值，停药处死后应用SABC免疫组化技术，观察GM中毒后不同时间豚鼠耳蜗血管纹HSP70表达情况。结果：GM组停药3d时耳蜗血管纹HSP70阳性反应产物表达最多，ABR阈值最高。以后随着停药时间延长，染色逐渐变浅，ABR阈值逐渐降低，停药30d时染色接近正常，但ABR阈值仍明显高于正常，它们与正常对照组相比差异均有显著意义（P﹤0.01）。结论：耳蜗血管纹HSP70阳性反应产物灰度值与ABR之间呈线性关系，可以作为细胞受到应激刺激后细胞恢复程度的一个指标。

【关键词】  耳毒性 庆大霉素 热休克蛋白 耳蜗 免疫组化

    AbstractObjective：To study the relationship of expression of heat shock protein 70(HSP70)in stria vascularis and ABR on gentamicin(GM) ototoxicity?induced in different time of guinea pigs cochlea. Methods : A total of 100 healthy white guinea pigs with red eyes were studied. They were all 200～250g weight and divided into two groups ,GM and saline control. Each group were medicated continuitly for 10 days.The auditory brainstem response (ABR) threshold on the 1st, 3 rd , 7th,14th, 30th day before administration and after discontinuation were detected.Immunohistochemistry staining was used to observe GM ototoxicity?induced expression of HSP70 . Results :The expression of positive production of HSP70 in stria vascularis of cochlea reached the maximum on the 3rd day after discontinuation in GM group, as well as the threshold of ABR . The staining truned to light gradually and the threshold of ABR degraded gradually accompanied with extension of time of discontinuation. The staining approached normol level on the 30th day after discontinuation, but the threshold of ABR was still higher than normol level, and there was significance compared with the control group (P﹤0.01). Conclusion: There was a linear correlation between the average gray of HSP70 in stria vascularis and the ABR thresholds. HSP is also the index of cell resuming after stress stimuli.

    Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓdrug toxity; gentamicins; heat shock protein;stria vascularis;immunohistochemistry

    庆大霉素（gentamicin ，GM）耳中毒后能够诱发耳蜗热休克反应,增加热休克蛋白（heat shock protein, HSP）70 在豚鼠耳蜗的表达, 且ABR 阈值变化与HSP70 表达的变化高度负相关，HSP70具有保护的作用[1]。用扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）的方法结合听脑干反应（auditory brainstem response，ABR）阈值的检测已经证明：GM耳中毒后豚鼠耳蜗毛细胞损伤后存活30d 者其耳蜗毛细胞形态上有所恢复，且ABR阈值也有一定程度的恢复，GM耳中毒后豚鼠耳蜗毛细胞具有再生修复能力[2]。那么， HSP70在GM耳中毒后不同时间是否也表达并具有保护听力的作用呢？HSP70的表达与ABR的关系如何呢？目前尚不清楚。本实验应用SABC免疫组化技术及图像分析技术并结合ABR测试，观察GM耳中毒不同时间豚鼠耳蜗HSP70表达及HSP70表达与ABR的关系，进一步探讨HSP70表达与GM耳中毒毛细胞再生修复的关系及作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物分组及耳毒模型的复制  耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠100只（沈阳医学院动物室提供），体重200～250g，雌雄不拘，随机分成正常对照组、GM组，每组50只。正常对照组：每日腹腔注射GM等量的生理盐水2.5ml/kg （河南三九益民制药有限公司生产，批号：2003042505?01）；GM组：每日腹腔注射硫酸GM注射液100mg/kg （沈阳第一制药厂生产，批号：030802?1）。各组皆连续用药10d。各组动物混合饲养，每日测量体重调整药量。

    1.2  ABR阈值检测  在用药前和停药后第1、3、7、14、30天，用1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉，利用Danac?7型声刺激器（日本ダナジャパン株式会社）发出主频率为2 kHz的滤波click声刺激信号，滤波带宽50～3000 Hz，间隔时间90 ms，扫描时间20 ms，耳机距豚鼠外耳道约0.5cm左右。记录电极置颅顶正中，电极及接地电极分别置于给声耳及对侧耳后乳突部皮下，以DAT?100型叠加仪（日本光电株式会社）进行叠加200次，以VC?10示波器（日本光电株式会社）输出信号，观察时程为20 ms，测试强度由95 dBnHL开始，按10dB递减，接近阈值后按5dB逐档递减，听阈判定以刚出现ABR 的P3波为准。

    1.3  耳蜗冰冻切片的制备  各组豚鼠在行第二次ABR检测后，将豚鼠快速断头，迅速取出听泡。打开听泡后，充分暴露耳蜗，在解剖显微镜下刺破圆窗膜，将镫骨底脱位暴露卵圆窗，在蜗顶钻一小孔，用微量注射器缓慢注入含40g/L多聚甲醛的磷酸缓冲液，再将标本置于上述固定液中4℃下2h。磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)冲洗后，放入100g/L EDTA中4℃下脱钙5～7d，再移入250g/L蔗糖磷酸缓冲液中，4℃过夜。次日用OCT包埋，行20μm恒冷冰冻切片。

    1.4  免疫组织化学方法检测HSP70  HSP70免疫组织化学方法检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。切片干燥后，用蒸馏水洗3次。将切片放入用甲醇稀释的5g/L H2O2中室温下浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。滴加抗原修复液，室温10min，蒸馏水洗3次。滴加正常血清封闭液，室温下孵育20min，甩去多余的液体，然后滴加稀释度为1：150的一抗，4℃过夜。用0.01mol/L的PBS（pH=7.4）洗3次。滴加二抗，室温孵育20min，用0.01mol/L的PBS洗3次。滴加SABC溶液，室温孵育20min，0.01mol/L的PBS漂洗4次，DAB显色，脱水，透明，封片。显微镜下观察。阴性对照组，用0.01mol/L的PBS代替一抗，其他程序不变。

    1.5  显微图像分析处理  采用MetaMorph/Coolsnapfx/AX70显微图像分析系统（美国、日本联合生产），每组随机抽取20张切片，将载玻片置于显微镜（10×40）下，呈现图像后，用数码照相机拍照后，将图像输入机，在同等条件下测量各组每张切片血管纹细胞HSP70阳性反应产物灰度值，分别计算各组血管纹细胞HSP70阳性反应产物平均灰度值。

    1.6  统计分析  将实验数据进行处理，数据以均值±标准差（x±s）表示，显著性检验采用t检验及相关分析。

    2  结果

    2.1  ABR阈值检测  各组ABR结果如表1所示。各组用药前ABR阈值差异无显著意义（P﹥0.05）。停药1d后， GM组的ABR阈值明显高于正常对照组（P﹤0.01）；停药3d时，GM组的ABR阈值最高，以后随着停药时间延长ABR阈值逐渐降低，但仍明显高于正常对照组（P﹤0.01）。表1  各组豚鼠用药前后的ABR阈值注：与用药前比较：1） P﹤0.01；与正常对照组比较：2）P﹤0.01

    2.2  HSP70免疫组织化学方法检测结果

    2.2.1  光镜观察结果  豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应产物呈棕黄色颗粒。正常对照组细胞：各时间组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应产物均呈弱阳性；GM组的豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应产物明显强于正常对照组，随着时间延长染色逐渐减弱，停药30d时染色接近于正常（如图1～3所示）。

　　2.2.2  图像分析  各组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应的平均灰度值结果如表2所示。GM组中停药后不同时间豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应产物的平均灰度值均较正常对照组明显减少（P﹤0.01），即GM能显著增强耳蜗HSP70的表达。在各时间组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应的平均灰度值,停药3d组其HSP70阳性反应的平均灰度值最低。停药30d时染色接近于正常，较正常对照组相比差异无显著意义（P＞0.01）。表2  各组豚鼠耳蜗各部分HSP70阳性反应的平均灰度值比较：与正常对照组比较：1）P﹤0.001；2） P﹤0.01

　　2.3  豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应的平均灰度值与ABR阈值的关系  停药后不同时间，随着各组豚鼠耳蜗HSP70阳性反应的平均灰度值的变化，ABR阈值也发生相应的变化，耳蜗血管纹HSP70阳性反应的平均灰度值越高，ABR阈值越低，它们之间呈负相关（表3）。即HSP70表达越少，ABR阈值越低。 表3  豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反应平均灰 度值与ABR阈值的相关分析注：相关系数的假设检验：1）P﹤0.001

    3  讨论

    实验结果表明，在各时间组豚鼠耳蜗ABR阈值检测中，停药3d时，GM组的ABR阈值最高；在各时间组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应的平均灰度值,停药3d组其阳性反应的平均灰度值最低。这意味着GM耳中毒后，以停药3d组受损最重，且HSP70的表达和生理功能具有一致的表现。

    HSP70的细胞保护作用是指在受到各种应激刺激时，产生HSP70可以增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞的正常功能代谢，提高细胞生存率[3]。在应激状态下，HSP70的表达及细胞保护作用与细胞的生理状态有关。Gutsmann等证明，随着机体衰老和细胞老化，HSP70和HSP70mRNA的功能和合成均有所降低，因而HSP表达的改变不仅可能是机体衰老和细胞老化的一个重要因素，而且还可以作为判断细胞生理状态和应激能力的一个标准[4]。实验结果表明，在GM耳中毒后HSP70表达增强，说明GM耳中毒耳蜗细胞生理功能状态良好。

    实验结果还证明，随着GM耳中毒后停药时间的延长，各组豚鼠耳蜗ABR阈值降低，且各组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反应产物减少、灰度值增加，HSP70阳性反应产物灰度值与ABR之间呈负相关。我们前期工作已经证明在停药30d时，GM耳中毒耳蜗毛细胞在形态和功能上均可有一定程度的恢复。因此我们认为，HSP还可以作为细胞受到应激刺激后细胞恢复程度的一个指标。

    目前，大多数学者认为HSP在应激情况下表达具有使听觉细胞免受进一步损害，具有保护的作用[5]。HSP的细胞保护作用与由于感染、中毒、缺血、缺氧引起毛细胞损伤，常伴有大量OH-·、O -·2和H2O2 的产生，促使细胞内“Ca2+超载”，以及细胞内蛋白质构型改变和功能障碍，由此引起细胞的应激反应。HSP通过反馈作用减少自由基的产生以保护细胞免受进一步损害有关。

    Na+/K+?ATP酶是所有高等动物的大多数细胞膜的一个组成部分[6]，也是内耳能量代谢和离子转运的关键酶之一，它是耳蜗代谢改变和早期病理变化的基础[7]。有报道AmAn耳毒性与耳蜗Na+/K+?ATP酶活性降低有关[8]。HSP可使严重受损而难以恢复的蛋白迅速降低，恢复细胞膜上Na+/K+?ATP酶活性[9]。在GM各时间组中，随着停药时间的延长，豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反应产物逐渐减少，且ABR阈值有所恢复，在停药30d时豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反应产物的灰度值和ABR阈值接近正常对照组。推测HSP70在GM耳中毒耳蜗毛细胞再生修复中可能与通过恢复细胞膜上Na+/K+?ATP酶活性，来降低GM的耳毒性，使耳蜗细胞恢复正常生理功能，促进耳蜗毛细胞的再生和修复有关。

【文献】
  [1] 倪月秋, 汤浩, 符文双, 等.豚鼠庆大霉素耳中毒后诱发的耳蜗热休克反应［J］. 应用生杂志，2002，18 (2)：179-182.

[2]Ni Yue?qiu，Tang Hao， Cui Cheng.Regeneration of cochlear hair cells of guinea pigs following gentamicin ototoxicity［J］. Zhongguo Linchuang Kangfu，2006，10（30）：177-179.

[3]郑磊，颜晓慧. 热应激时热休克蛋白70及其细胞保护作用［J］. 国外医学卫生学分册，1999，26（4）：209-212.

[4]Gustmann CA，Heydari AR，You S，et al. The expression of heat shock protein70 decreases with cellular senescence in vitro and in cells derived from young and old human subjects［J］.Exp Cell Res，1998，241(2):404-413.

[5]Lim HH, Jenkins OH, Myers MW, et al. Detection of HSP72 synthesis after acoustic overstimulation in rat cochlea［J］. Hear Res, 1993，69:146-150.

[6]Schulte BA, Adams JC. Distribution of immunoreactive Na+,K+?ATPase in gerbil cochlea［J］. J Histochem Cytochem, 1989，37: 127-134

[7]楮汉启，熊浩，韩芳，等. 离子转运蛋白抑制-听觉实验研究NKCCl和Na+，K+?ATPase在耳蜗K+循环中的作用［J］. 华中科技大学学报（医学版），2006，35（5）：630-632；637.

[8]李朝军，刘兆华，王锦玲.内耳Na+/K+?ATP酶的研究进展［J］. 国外医学耳鼻咽喉分册，1993，17（6）：321-325.

[9]许川山，吴士明. 热休克蛋白表达与脑缺血损害［J］.康复, 2000，4（11）：1694-1695