LMO3 mRNA在小鼠脑发育过程中的表达

               作者：惠玲，蔡文琴，纪华，吕同德，杨金升，赵治华  

【关键词】  LMO3；原位杂交组织化学；小鼠；脑

　　【Abstract】 AIM: To examine the localization of neuronal specific transcription factor LMO3 mRNA in the development of central nervous system (CNS) of the mice. METHODS: Realtime fluorescence quantitative RTPCR(FQ RTPCR) and in situ hybridization histochemical staining method with digoxinlabeled cRNA probe were used to detect the expression of  LMO3 mRNA. RESULTS: The FQ RTPCR showed that the expression of LMO3 mRNA was the highest during pregnancy, then it decreased significantly after birth and almost remained the same level until adult. LMO3 mRNA expression was extensive in brain at early embryonic stages (E10.511.5 d), but not detected at other parts of embryo. The high level in brain was still seen over mid(E15.5d) and late (E17.5P0 d) embryonic brain and showed less different signal. During postnatal development, LMO3 mRNA was found gradually regionalized and showed the difference of signal in different parts of brain. LMO3 mRNA expression of P14P60 d was still extensive although the extent was gradually  more regional than that of  P7d. The signal of  LMO3 mRNA was mainly located in different nucleus clony and showed different intensity. CONCLUSION: LMO3 plays a role in brain development during embryonic period and postnatal differentiation and specification of specific brain regions.

　　【Keywords】 LMO3; in situ hybridization histochemistry; mice; brain

　　【摘要】 目的： 研究不同发育时期小鼠脑内LMO3的表达. 方法： 采用以SYBR Green I为荧光染料的定量RTPCR及以地高辛标记的cRNA为探针的原位杂交组织化学法检测LMO3基因在小鼠脑发育过程中的表达. 结果： FQ RTPCR结果表明，LMO3在出生前高表达，P7d后表达水平急剧下降，至成年都维持在一个较低的水平. LMO3 mRNA在小鼠胚胎期E10.5d即有表达，但仅限于整个脑泡组织内，胚体其他区域均为阴性；E11.5d脑区信号逐渐加强，无核团及脑区的特异性，胚体其他部分仍为阴性；E15.5～P0d期LMO3阳性信号在几乎所有观察的脑区均有广泛而较强的着色；P7d LMO3阳性信号较出生前变弱，分布逐渐集中；P14～P60d LMO3 mRNA表达范围较P7d逐渐缩小，但仍有广泛表达，阳性信号主要集中于不同核团，表达有强弱之分. 结论： LMO3基因可能与小鼠出生前脑的发育以及出生后特定脑区神经元的特化及特性维持有关.
 
　　【关键词】 LMO3；原位杂交组织化学；小鼠；脑

　　0引言

　　多巴胺相关转录因子DAT1 (GenBank登录号： AF258348)又称LMO3，是我们获得的星形胶质细胞在DA作用下发生反应性变化时上调表达的基因之一［1］. LMO家族由4个成员组成，即LMO1～LMO4. 我们以往的研究证实LMO3 mRNA在成年大鼠和小鼠的中枢神经系统（CNS）中分布广泛，提示LMO3基因在CNS有重要作用［2］.  本试验采用实时荧光定量RTPCR方法及原位杂交组织化学的方法对LMO3 mRNA在小鼠脑发育过程中的表达变化进行了研究，以探讨LMO3在神经系统发育中的作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料成年昆明种雌雄小鼠由本院实验动物中心提供. 于每日18：00按雌雄1∶1合笼，次日晨取出，检查雌鼠的阴道口有无阴栓，有阴栓者既定为孕期0 d(E0d)，出生当日为生后1 d(P0)，依此类推. 分别取E10.5，E11.5, E15.5，E17.5，P0，P7，P14，P30，P60 d的小鼠，每组5只，进行原位杂交检测并提取总RNA后用于荧光定量RTPCR试验. 地高辛标记小鼠LMO3 cRNA寡聚核苷酸探针由湖北武汉博士德公司合成.
 
　　1.2方法

　　1.2.1荧光定量RTPCR采用Tri 201试剂提取制备总RNA，测定A260 nm对RNA进行准确定量. 取2 μg总RNA，经MMLV逆转录酶催化合成cDNA第一链，以此为模板进行荧光定量PCR扩增，荧光介质选用SYBR Green I，根据同时扩增的标准曲线，出各样本的初始拷贝数，结果以LMO3 copies/G3PDH copies表示LMO3 mRNA在各组起始RNA中的相对含量. 在PCR后进行融解曲线分析以确定得到的产物是否为目的产物，温度以0.2℃/s的速率从55℃缓慢递增到100℃. 同时将反应产物置20 g/L琼脂糖凝胶电泳进一步观察扩增产物的特异性.
 
　　1.2.2原位杂交组织化学全胚胎原位杂交  新鲜取材的鼠胚(E10.511.5)用PBS洗2次，入4%多聚甲醛固定过夜，PBT洗2次后，用250 mL/L甲醇PBT, 500 mL/L甲醇PBT, 750 mL/L甲醇PBT, 纯甲醇PBT梯度脱水，(可-20℃储存备用，用时再用甲醇PBT水化)，用含60 mL/L H2O2的PBT漂洗1 h, 10 μg/mL的蛋白酶K消化，2 mg/mL甘氨酸洗2次，2 g/L戊二醛后固定20 min,杂交液中70℃预杂交2 h，含1 μg/mL LMO3探针的杂交液中过夜,溶液Ⅰ洗2次，每次30 min,溶液Ⅱ洗2次，每次10 min, 100 μg/mL RNaseA洗2次，每次30 min；TBST洗3次，100 mL/L羊血清室温封闭1 h，抗地高辛抗体1∶1000孵育过夜，TBST洗5次，新鲜配制的AKP Buffer(pH 8.0)洗3次，NBT/BCIP暗处显色，PBT洗3次，中止显色，40 g/L多聚甲醛固定过夜，PBT漂洗，甘油透明，4℃保存. 同时设阳性及阴性对照(同切片原位杂交).
 
　　切片原位杂交：0.1 mol/L PBS(pH 7.2)漂洗5 min×3次，3 g/L TritonX100/PBS(RNase free)漂洗25 min，蛋白酶K(2 μg/mL)于37℃孵育30 min，(于0.1 mol/L TrisHCL pH 8.0; 50 mmol/L EDTA缓冲液中)，40 g/L多聚甲醛中漂洗5 min×2次，0.1 mol/L PBS(RNase free)漂洗5 min×2次，浸入新配制的0.1 mol/L TrisHCL (pH 8.0，含25 g/L乙酸酐)5 min, 2×SSC漂洗10 min，切片在含0.5 μg/mL地高辛标记的LMO3 cRNA探针的杂交液中42℃反应24 h后，20×SSC中漂洗15 min，转入4×SSC中漂洗5 min，2×SSC中(含RNaseA 20 μg/mL)漂洗30 min(37℃)，1×SSC，0.5×SSC中各漂洗10 min(37℃)，0.05 mol/L PBS漂洗10 min×2次，将切片移入碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体中孵育4 h(37℃)，0.05 mol/L PBS漂洗10 min×3次，TSM1，TSM2中各漂洗10 min×2次，用NBT/BCIP显色液显色3～5 h(室温)，裱片、脱水、DPX封片.  阴性对照将切片用RNaseA进行预处理后杂交，以不含探针的杂交缓冲液取代含DigLMO3cRNA探针的杂交液；阳性对照为以地高辛标记的GFAP探针代替LMO3探针进行杂交染色.

　　2结果

　　2.1小鼠脑不同发育时期LMO3 mRNA表达采用以SYBR Green I为荧光染料的定量PCR，结果表明LMO3在P0 d以前高表达，出生后表达量急剧下降，至成年基本维持在一个较低的水平（图1）. 此外，为了确定产物的特异性，我们分析了产物的融解曲线(melting curve)，LMO3扩增产物只在90℃左右出现一个高峰，GAPDH也只在79℃左右有一个高峰；并且凝胶电泳的结果也显示条带单一（图2），表明无非特异性扩增.

　　E15.5： 胚胎15.5 d; P0, P7, P14, P30, P60：出生后 0, 7, 14, 30, 60 d.

　　图1荧光定量RTPCR检测小鼠脑不同发育时期LMO3 mRNA的表达（略）

　　M: Marker; E15.5： 胚胎15.5 d; P0, P7, P14, P30, P60：出生后 0, 7, 14, 30, 60 d.

　　图2LMO3及G3PGH荧光扩增（略）

　　2.2LMO3 mRNA在小鼠CNS发育过程中表达全胚胎原位杂交及切片原位杂交可见，LMO3阳性信号为蓝紫色，主要位于神经元的胞体及突起内,但核内也可见LMO3染色.
 
　　E10.5：LMO3 mRNA在小鼠胚胎期E10.5d即有表达，阳性信号可见于端脑、间脑、中脑、后脑、末脑等脑泡，胚胎其他部位为阴性(图3A)；E11.5 d阳性信号加强，仍位于上述脑区(图3B)；E15.5～P0切片原位杂交显示，LMO3 mRNA在整个脑部切片中均有较强而广泛的分布，着色基本一致，除在E17.5及P0 d海马的颗粒层、大脑皮质、嗅球的内丛层及僧帽细胞层可见较周围组织有明显增强的染色，其他部位阳性信号无明显强弱区分.P7：LMO3阳性信号较出生前变弱，分布逐渐集中，在少数核团可看到中等强度的着色，如在嗅内皮质（图3B），海马锥体细胞层(3C)，面神经核、舌下神经核、脊髓灰质等部位可见强的阳性信号；大脑皮质颗粒层、海马齿状回(图3C)等部位可见到中等强度的阳性细胞，其他大部分脑区的阳性信号均较弱，但分布很广. P14P60： LMO3 mRNA阳性信号进一步区域化，阳性信号主要集中于不同核团，大脑皮质锥体细胞层、僧帽细胞层，海马齿状回(3D)，下托，CA3区(图3D)，杏仁复合体、红核、黑质、舌下神经核、中缝背核、小脑顶核、上丘浅灰质层、脊髓前角和侧角等部位呈现强阳性信号，海马CA1，CA2(3D)，室旁核、面神经核、前庭神经核、舌下神经核、桥核、迷走神经核、楔束外核、孤束核等核团呈现中等强度着色，前嗅核、尾壳核、三叉神经脊束核、疑核、外侧上橄榄核、小脑间置核、小脑外侧核、小脑浦肯野细胞等有较弱的染色.

　　A： 胚胎期局限表达于脑部E10.5×20; E11.5×40；B：  (P7 d)嗅内皮质×200；C：  (P7 d)海马及齿状回×100；D：  (P60 d)海马及齿状回×40.

　　图3小鼠LMO3 mRNA表达（略）

　　3讨论

　　我们用荧光定量RTPCR方法检测了LMO3 mRNA在小鼠脑不同发育时期的表达变化，结果表明LMO3在P0 d以前高表达，出生后表达量急剧下降，至成年基本维持在一个较低的水平，LMO3在胚胎期的高表达表明它可能对脑的早期发育有重要作用. LMO1～LMO4在发育小鼠的CNS均有较高表达［3-7］，它们是神经发育的调节因子［8］. Hahm等［9］研究发现LMO4可与Deaf1发生相互作用，并在影响神经管闭合的神经通路中有重要作用；同时Tse等［8］采用基因敲除小鼠，分别研究了LMO1，LMO3，LMO4基因缺失小鼠的形态及功能变化，显示LMO4缺失小鼠由于神经管缺陷而出现无脑或露脑畸形，导致妊娠期胚胎死亡，而LMO1/LMO3联合突变的小鼠虽未见明显可见的形态异常，但出生后24 h内即死亡，表明LMO1，LMO3，LMO4分别在不同的神经发育途径中有重要作用［7］.
 
　　全胚胎原位杂交的结果显示LMO3在胚胎早期只表达于脑部，而胚体其他部位未见表达，而LMO4除了在胚胎脑中表达外，在胚体的耳泡、肢芽、体节等部位也有表达［5］. LMO3在胚胎早期脑组织中的表达与LMO1在胚胎脑中的表达相似，有研究表明LMO1在E9d脑的神经元中开始表达，在E9～E10d的后脑表达最强［7］，我们的结果显示LMO3在E10.5d的后脑表达也较强，进一步提示LMO家族成员在脑发育及成年时表达上的部分重叠，虽然这种重叠是否也发生在单一的细胞水平以及这种现象在神经系统发育中的深远意义还有待于进一步的研究.

　　【】

　　［1］ Shi J, Cai W, Chen X, et al.  Identification of dopamine responsive mRNAs in glial cells by suppression subtractive hybridization ［J］. Brain Res, 2001,910(12):29-37.

　　［2］ 惠玲，蔡文琴，石军，等.  神经特异性转录因子DAT1 mRNA在大鼠中枢神经系统的定位［J］. 解剖学报，2004,35(2):122-126.

　　［3］ Lee SK, Jurata LW, Nowak R, et al. The LIM domainonly protein LMO4 is required for neural tube closure ［J］. Mol Cell Neurosci, 2005,28(2):205-214.

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　　［5］ Kenny DA, Jurata LW, Saga Y, et al. Identification and characterization of LMO4, an LMO gene with a novel pattern of expression during embryogenesis ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1998,95(19):11257-11262.

　　［6］ Chen HH, Yip JW, Stewart AF, et al. Differential expression of a transcription regulatory factor, the LIM domain only 4 protein Lmo4, in muscle sensory neurons ［J］. Development, 2002,129(21):4879-4889.

　　［7］  Hinks GL, Shah B, French SJ, et al. Expression of LIM protein genes Lmo1, Lmo2, and Lmo3 in adult mouse hippocampus and other forebrain regions: differential regulation by seizure activity ［J］. J Neurosci, 1997,17(14):5549-5559.

　　［8］  Tse E, Smith AJ, Hunt S, et al. Null mutation of the Lmo4 gene or a combined null mutation of the Lmo1/Lmo3 genes causes perinatal lethality, and Lmo4 controls neural tube development in mice ［J］. Mol Cell Biol, 2004,24(5):2063-2073.

　　［9］ Hahm K, Sum EY, Fujiwara Y, et al. Defective neural tube closure and anteroposterior patterning in mice lacking the LIM protein LMO4 or its interacting partner Deaf1 ［J］. Mol Cell Biol, 2004,24(5):2074-2082.