脂多糖致大鼠急性肺损伤早期Ⅰ型前胶原羧基端肽的表达
作者：高鸿美 焦光宇 李胜歧
【摘要】 观察脂多糖（LPS）致大鼠急性肺损伤（ALI）早期是否存在肺纤维增生, 探讨其在ALI发病机制中的作用。 方法: 将27只SD大鼠随机分成3组，其中对照组为气管内滴注NS（生理盐水）12h后取材，LPS1组、LPS2组为气管内滴注LPS 1.0ml/kg（浓度为100μg/ml）后分别于12h、24h取材。用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法测定血清及肺泡灌洗液（BALF）中Ⅰ型前胶原羧基端肽（PⅠCP）的浓度。 结果: LPS2组大鼠血清PⅠCP浓度为（64.75±11.97）μg/L显著高于对照组（12.38±3.59）μg/L和LPS1组（13.96±4.30）μg/L（P<0.05），而LPS1组和对照组间差异无显著性（P>0.05）；LPS2组大鼠BALF中PⅠCP浓度为（35.26±3.32）μg/L显著高于对照组（6.90±1.99）μg/L和LPS1组（6.92±2.50）μg/L（P<0.05），而对照组和LPS1组间差异无显著性（P>0.05）。 结论: LPS致大鼠ALI后24h血清及BALF中PⅠCP浓度显著增高提示ALI早期肺纤维增生存在。
【关键词】 脂多糖 急性肺损伤 型前胶原羧基端肽
Expression of Type Ⅰ Procollagen Peptide in Rat with Early Acute Lung Injury Caused by Lipopolysacharide
AbstractObjective:To observe the fibroproliferation occurs early in the acute lung injury（ALI）caused by lipopolysacharide（LPS）.Methods: Twenty?seven SD rats were divided into 3 groups randomly, the control group was instilled saline into trachea for 12h; and the lung samples were made .The LPS1group and LPS2 group were instilled LPS 1.0 ml/kg(100μg/ml)for 12h and 24h respectively ,and the lung samples were made.TypeⅠprocollagen peptide(PⅠCP)was detected by ELISA in serum and bronchoalveolar lavage fluid(BALF).Results:The serum PⅠCP concentration in LPS2 group (64.75±11.97) μg/L,was significantly higher than that in control group(12.38±3.59) μg/L and LPS1 group(13.96±4.30) μg/L (P<0.05). Control group and LPS1 group had no significant difference(P>0.05). The BALF PⅠCP concentration in LPS2 group(35.26±3.32) μg/L,was significantly higher than that in control group(6.90±1.99) μg/L and LPS1 group(6.92±2.50) μg/L (P<0.05).Control group and LPS1 group had no significant difference(P>0.05). Conclusions: The significant increase of PⅠCP in serum and BALF after 24h in ALI caused by LPS indicate the existence of lung fibroproliferation.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓlipopolysacharide(LPS);acute lung injury(ALI);typeⅠprocollagen peptide(PⅠCP)
急性肺损伤（ALI）被认为是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的早期表现。ALI过程中肺纤维增生可以通过增加呼吸膜的厚度进而影响早期气血交换，减小肺顺应性，影响预后。而Ⅰ型前胶原羧基端肽（PⅠCP）是胶原合成过程中的水解产物，可以反映Ⅰ型胶原的合成情况。本实验通过检测脂多糖（LPS）致大鼠ALI早期（24h内）血清及肺泡灌洗液（BALF）中PⅠCP的含量，来检测ALI/ARDS早期是否有肺纤维增生的存在，并为早期抗纤维化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 27只SD大鼠由医科大学动物中心提供，雌雄不拘，体重（275±25）g，饲养于洁净、温控的动物中心实验室以避免肺部感染的发生，正常进食水。
1.2 主要试剂、器材 ①脂多糖LPS：E.coli，内毒素055: B5 LPS（Sigma.Co）。②大鼠血清及上清液PⅠCP酶联免疫吸附试剂盒（美国进口分装，购于大连泛邦生物技术公司）。③低温离心机：Hettich 32R（德国生产）。④酶标仪（芬兰雷博公司生产）。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物的分组及处理 将27只SD大鼠随机分成3组：对照组（9只）、LPS1组（9只）、LPS2组（9只）。对照组气管内滴注生理盐水1.0ml/kg，LPS1组及LPS2组气管内滴注LPS 1.0ml/kg（浓度为100μg/ml）建立ALI动物模型。将滴注LPS的大鼠随机分成两组，其中给药后观察12h取材的为LPS1组，给药后观察24h取材的为LPS2组。
1.3.2 肺损伤的评价 肺损伤严重程度可根据以下标准判定：（1）测定肺湿重/干重（W/D）比值：结扎左主支气管剪取一部分左肺组织称湿重（W），然后置于60℃温箱中，7天后称干重（D），求得W/D。（2）血清和BALF白蛋白测定：动物处死后，心脏采血，离心后取血清测白蛋白；右主支气管进行肺泡灌洗，首次灌注PBS液15.0ml/kg，以后灌注量为前一次的回收量，共灌注4次，每次冲洗3遍，将回收的BALF混合计量，离心后测上清液白蛋白浓度。（3）观察肺组织病理表现：取右肺置于10%甲醛溶液中固定12h，常规脱水、包埋、制成蜡块，经切片、HE染色，观察肺组织病理表现。
1.3.3 血清及肺泡灌洗液PⅠCP浓度测定 PⅠCP采用酶联免疫吸附法测定，按照试剂盒说明书进行操作，反应结束后15min内在450nm处读OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
1.4 统计学分析 结果以均数±标准差（x±s）表示；采用SPSS11.5统计软件，多组间比较用方差分析,组间比较用q检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 LPS致大鼠ALI评价
2.1.1 肺组织的病理改变 NS对照组：肺组织大体无异常所见。光镜可见肺泡结构完整，未见明显病变（图1）。LPS1组：大体观可见所有肺组织均有肿胀，背膜光亮，有部分可见被膜下出血点。光镜可见肺内弥漫性炎症细胞浸润，以中性粒细胞为主，肺泡腔内有红细胞渗出，有局限性肺气肿和肺不张，肺毛细血管扩张呈不规则形，毛细血管及支气管周围间隙增宽、水肿；肺泡间隔及肺泡间质轻度水肿（图2）。LPS2组：大体观见肺组织发黄。光镜下肺泡腔内可见中性粒细胞浸润，并有少量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，肺泡内及间质均有红细胞浸润，部分肺泡壁破坏、肺泡融合形成局灶性肺气肿，有部分肺泡不张；肺泡间隔明显增厚，间质增生，有淋巴细胞、巨噬细胞及成纤维细胞浸润，有毛细血管扩张，形状不规则（图3）。
2.1.2 血清、BALF中白蛋白含量 如表1所示，图1 NS对照组肺组织 HE×100 图2 LPS1组肺组织毛细血管扩张，肺泡腔内可见中性粒细胞
和红细胞浸润、肺水肿和轻度间质增厚 HE×100 图3 LPS2组肺组织水肿间质增厚，肺泡腔内明显
中性粒白细胞浸润 HE×100对照组及各实验组间血清白蛋白差异无统计学意义（P>0.05）。BALF中白蛋白在损伤12h浓度明显高于对照组，在24h浓度有所降低，但仍高于对照组；三组间的差异均具有统计学意义（P<0.05），说明富含蛋白的水肿液渗入肺泡腔。
2.1.3 肺组织湿重/干重（W/D） 如表1所示，肺W/D表明：肺损伤12 h组动物与对照组相比W/D明显升高（P<0.05），而24h组与对照组无差异（P>0.05），说明损伤12h组肺水肿最明显。表1 ALI大鼠不同时相血清、BALF中白蛋白含量和肺组织湿重/干重注：组间比较1）P>0.05；2）3）P<0.05
2.2 血清及BALF中ＰⅠＣＰ浓度 如表2所示，血清及BALF中ＰⅠＣＰ浓度在损伤12h与对照组比较无差异（P>0.05），而损伤24h其浓度显著高于对照组，具有统计学意义（P<0.05）。 表2 血清及BALF中PⅠCP含量 注：组间比较1）P>0.05；2）P<0.05
3讨论
本研究通过气管内注入LPS的方法建立ALI动物模型，发现BALF中蛋白含量明显增加，并且肺湿重/干重明显高于对照组，说明富含蛋白的水肿液渗入肺泡内，结合实验动物的病理表现显示ALI动物模型建立成功。
ARDS和ALI是以顽固性低氧血症，呼吸频数和呼吸窘迫为主要表现的临床综合征，ARDS的病理过程可以分为三个阶段：渗出期、增生期和纤维化期, 病死率高，肺纤维化是直接或间接导致ALI /ARDS患者死亡的原因之一。积极逆转肺纤维增生可能会改善ALI /ARDS的预后。胶原合成是肺纤维化形成的重要标志。胶原蛋白的合成同时释放可溶性的N?末端及C?末端前胶原肽。因此，测定可溶性Ｎ?末端及Ｃ?末端前胶原肽，可以作为胶原合成的标志物[1]。肺间质以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主，ＰⅠＣＰ为Ⅰ型前胶原羧基端肽。ＰⅠＣＰ的产生仅与Ⅰ型胶原合成有关，在BALF中的含量不受Ⅰ型胶原降解的影响[2]，能更好地反映Ⅰ型胶原的合成情况。本实验检测了LPS致大鼠急性肺损伤不同时段血清及BALF中ＰⅠＣＰ的浓度，其结果显示在LPS致大鼠急性肺损伤12h组血清及BALF中ＰⅠＣＰ浓度无显著增高，而在损伤24h ＰⅠＣＰ浓度显著高于正常对照组，肺组织病理结果显示24h肺组织损伤程度比12h肺损伤程度严重，说明：前胶原肽主要来自损伤的肺组织，损伤愈重ＰⅠＣＰ浓度增加愈明显 。Chesnutt等学者研究认为ＡＲＤＳ所致的肺水肿、肺损伤导致可溶性的前胶原肽进入肺泡,ＡＲＤＳ早期开始肺纤维增生[3]。Marshall等研究表明在ARDS早期BALF中，非存活组的Ⅲ型前胶原氨基端肽（ＰⅢＮＰ）浓度明显高于存活组[4]。另外有研究表明ＢＡLＦ中的前胶原肽浓度是反映ARDS患者预后的指标之一[5～7]。我们研究也显示ALI大鼠24h BALF中ＰⅠＣＰ浓度显著高于对照组和损伤12h组，而24h组比12h组肺损伤严重；说明BALF中ＰⅠＣＰ浓度愈高，肺损伤愈重。
本研究显示ALI的肺纤维增生过程在早期渗出期就已经启动，表现为胶原合成增加，从而推测如果在ALI/ARDS早期干预胶原合成可能有利于逆转其预后，降低死亡率。至于机体是如何启动胶原合成基因、受何种因素影响还有待于进一步研究。
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