乌司他丁（天普洛安）对大鼠放射性肺损伤过程中TGF?β1的影响

【摘要】  目的： 探讨乌司他丁（天普洛安）对大鼠放射性肺损伤过程中TGF?β1水平的影响，探讨其在放射性肺损伤中的作用. 方法： 60只雌性SD大鼠随机分为3组： 对照组（C组）、单纯照射组（R组）、乌司他丁治疗组（U组）. R及U组大鼠行直线加速器全胸部照射一次，剂量为20 Gy. 照射后U组通过尾静脉注射乌司他丁［10 000 U/（kg·d）］，共计7 d；C，R组注射同等体积的生理盐水. 于照射后7，15，30，60 d处死动物，取部分组织行HE染色及Masson染色观察组织学及肺胶原蛋白等，另取部分组织行免疫组化染色观察TGF?β1阳性细胞；使用酶联免疫吸附分析法检测肺泡灌洗液和血清中TGF?β1水平. 结果： R，U组在照射后肺间质密度、TGF?β1阳性面积以及肺泡灌洗液和血清中TGF?β1水平随时间增加而逐渐升高，其中以R组30，60 d时与C组比较最为明显(P<0.01)，同时可以发现U组与同期R组相比较具有统计学意义(P<0.01)；肺泡灌洗液和血清中TGF?β1水平变化与肺组织病变化趋势基本一致. 结论： TGF?β1在放射性肺损伤发病机制中起到重要作用，间接地反应了放射性肺损伤程度，乌司他丁能通过显著降低TGF?β1的水平，从而抑制炎症反应的发生与，有效地防护放射性肺损伤.

【关键词】  乌司他丁 转化生长因子β1 肺 辐射损伤

    0引言

    放射性肺损伤是临床胸部肿瘤放疗、骨髓移植预处理、平时核辐射事故及战时核辐射后严重并发症. 研究发现转化生长因子β1（TGF?β1）在放射性肺损伤中起到重要作用［1］. 乌司他丁（天普洛安）是一种广谱的蛋白酶抑制剂，能够抑制多种细胞因子及炎症介质，在临床上已经广泛应用于多个领域，我们通过动物实验建立放射性大鼠肺损伤模型，发现乌司他丁能有效降低TGF?β1水平，为治疗放射性肺损伤提供了一种新的方法.

    1材料和方法

    1.1材料健康雌性SD大鼠60只，体质量(180±20) g，购于第四军医大学实验动物中心；采用德国西门子公司的6MV?X直线加速器；图像采集使用OLYMPUS?BX?51型号显微镜系统；图像分析使用美国Media Cybernetics公司的Image?Pro Plus 6.0图像分析软件；酶标仪使用美国BioRad公司生产的Bio?Rad450型；TGF?β1大鼠酶联免疫吸附测定试剂盒及兔抗大鼠TGF?β1 mAb试剂盒购于美国Santa Cruz公司；ABC免疫组化试剂盒购于美国Sigma公司；乌司他丁（天普洛安）购于广东天普生化医药股份有限公司.

    1.2方法

    1.2.1动物模型制备与实验分组60只雌性SD大鼠随机分为3组（每组20只）：正常对照组（C组）、单纯照射组（R组）、乌司他丁治疗组（U组）. 后两组动物经戊巴比妥40 mg/kg腹腔麻醉后，以自制的装置固定大鼠，胸部覆以23 mm厚蜡块以调整剂量分布，铅屏蔽头部与腹部行直线加速器全胸部照射，单次剂量为20 Gy（2 Gy/min），距离1 m，面积4.5 cm×4.5 cm. U组于照射当日开始以乌司他丁10 000 U/kg尾静脉注射，而后每天相同剂量静注，共计7 d；C，R组同期尾静脉静注同等体积的生理盐水.

    1.2.2标本采集于照射后7，15，30，60 d每组取5只麻醉后，直接从心脏采血2 mL，立刻置入含EDTA的抗凝管中混匀，静置30 min后以1500 r/min离心15 min，留取血浆冻存于-70℃；将大鼠右侧肺门结扎,气管插管,注入生理盐水4 mL,保留3 min后吸出,反复3次,收集支气管肺泡灌洗液BALF,将BALF 4℃离心(3000 r/min, 4 min),吸取上清液冻存于-70℃待测；取右下肺以40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片.

    1.2.3肺组织病理学观察各组大鼠肺组织石蜡切片分别行苏木素?伊红（HE）染色观察动物肺组织一般病理学改变，每例实验动物选5张切片，运用OLYMPUS?BX51显微图像采集系统100倍下每张切片随机选取10个高倍镜视野观察. ImagePro?Plus 6.0（美国Media Cybernetics公司）医学图像分析软件进行机图像分析，测定肺间质面密度等；同法用Masson染色观察肺组织胶原蛋白沉积情况.

    1.2.4免疫组化检测TGF?β1的表达取包埋好切片，按试剂盒说明书步骤进行，兔抗大鼠TGF?β1多克隆抗体稀释度为（1∶100），DAB显色，苏木素轻度复染核，光镜下观察. 结果以胞质内可见棕红色颗粒者为阳性，以肺泡实质TGF?β1阳性表达面积作为检测TGF?β1表达的半定量指标.

    1.2.5酶联免疫吸附（ELISA）方法测定TGF?β1的含量取冻存的血浆及肺泡灌洗液，按照试剂盒说明书步骤严格操作.

    统计学处理：采用SPSS12.0统计软件进行数据分析，正态分布数据以x±s表示，行单因素方差分析及SNK?q检验，P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1肺组织病理学变化HE染色显示C组肺组织结构正常；R组7 d肺泡壁增厚，肺毛细血管扩张、充血，少量炎细胞浸润，15 d出现局限性炎症浸润灶，30，60 d肺水肿明显，局限性肺实变；U组各期炎症、水肿均较R组减轻（图1）. R组在照射后30，60 d肺间质面密度逐渐增大(P<0.01)，而U组与同期R组比较明显减小(P<0.01，表1）. Masson染色显示C组可见淡蓝色的基质胶原较少，主要分布在气道及血管外膜. R组7，15 d基质胶原与C组相比较稍有增加，30 d以后血管外膜及肺泡间隔胶原纤维增多，U组与R组同期相比胶原纤维减少（图2）.表1不同组间放射性肺损伤肺间质面密度的变化

    2.2TGF?β1免疫组化检测C组肺组织TGF?β1在肺泡间隔、细支气管平滑肌、血管平滑肌、血管内皮、血管周围仅弱表达或不表达，阳性面积少；R组在30,60 d时上述部位明显比C组表达增强，并出现肺泡上皮细胞、肺间质巨噬细胞强阳性表达，阳性面积随之明显增加（P<0.01），U组表达部位与C组相似，阳性面积较R组明显减少（P<0.01，图3，表2）.

    A： 正常对照组； B： 单纯照射组； C： 乌司他丁组.

    图3各组大鼠肺组织TGF?β1免疫组化染色（30 d）×400表2大鼠肺组织TGF?β1免疫组化阳性面积变化 (n=5，μm2，x±s)组别〖〗照射后（d）7〖〗15〖〗30〖〗60C〖〗221±32〖〗241±27〖〗238±23〖〗229±19R〖〗317±29〖〗528±39b〖〗965±49b〖〗1367±113bU〖〗243±22〖〗379±31c〖〗586±26d〖〗763±59dbP<0.01 vs C； cP<0.05， dP<0.01 vs R. C: 对照组; R: 单纯照射组; U: 乌司他丁治疗组.

    2.3TGF?β1 ELISA检测随照射后时间延长，R组血清TGF?β1水平逐渐升高，30 d时较前增加趋势明显，60 d时达高峰，较C组相比较具有统计学差异性，同时U组TGF?β1水平也缓慢增加，但较R组减少（P<0.01）；肺泡灌洗液中TGF?β1水平和血清基本一致，不同的是30 d时达到高峰后开始下降（表3）.表3放射性肺损伤血清及肺泡灌洗液内TGF?β1水平的变化

    3讨论

    放射性肺损伤的发生是多因素引起的，既牵涉到射线所损伤的多个靶细胞，又涉及到这些靶细胞和其相关细胞所释放出来的多种细胞因子［2］；晚期则随着组织的修复、肉芽的生长逐渐出现以纤维细胞增生、基质胶原化为主的肺间质纤维化的改变，从而导致患者呼吸衰竭，成为主要死因之一. 目前对放射性肺损伤的治疗，有针对早期炎症阶段的糖皮质激素、非甾体类消炎药及辅助r?干扰素和减轻肺损伤的药物. 上述治疗大多以减轻早期炎症，后期仍有大量的肺间质纤维化形成，治疗效果不能令人满意.

    TGF?β1是人体多种上皮起源细胞的生长调节因子，在细胞的生长、分化及细胞外基质沉积和机体免疫反应方面具有广泛的生物学效应［3］，被公认为与放射性肺纤维化发生和形成关系最为密切的介导因子，在放射性肺炎的发生和维持过程中占有重要地位［4-5］. 通过HE和Masson染色观察到照射后大鼠肺泡II型上皮细胞、血管内皮等细胞损伤，逐渐出现肺水肿以及肺泡炎症等，放射性肺炎症程度逐渐加重，这与照射后肺组织中、血清、肺泡灌洗液的TGF?β1水平变化基本一致，说明TGF?β1在放射性肺损伤发生、过程中的重要作用. 而乌司他丁治疗组与R组相比，大鼠肺水肿及肺泡炎症等明显减轻，另外乌司他丁能修复肺泡II型上皮细胞、血管内皮细胞损伤，明显抑制肺胶原蛋白沉积及纤维增生，由此可见乌司他丁具有防护放射性肺损伤的作用，其机制与抑制TGF?β1表达有关.

    综上所述,乌司他丁能有效降低放射性肺损伤时TGF?β1的含量，并抑制肺组织炎症反应，为寻找预防及治疗放射性肺损伤及纤维化找到一条新路径.

【】
  ［1］ Yi ES, Bedoya A, Lee H, et al. Radiation?induced lung injury in vivo: expression of transforming growth factor?beta precedes fibrosis ［J］. Inflammation, 1996,20(4):339-352.

［2］ Schallenkamp JM, Miller RC, Brinkmann DH, et al. Incidence of radiation pneumonitis after thoracic irradiation: Dose?volume correlates ［J］. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2007,67(2):410-416.

［3］ Kim SH, Lim DJ, Chung YG, et al. Expression of TNF?alpha and TGF?beta 1 in the rat brain after a single high?dose irradiation ［J］. J Korean Med Sci, 2002,17(2):242-248.

［4］ Evans ES, Kocak Z, Zhou SM, et al. Does transforming growth factor?beta1 predict for radiation?induced pneumonitis in patients treated for lung cancer［J］? Cytokine, 2006,35(3-4):186-192.

［5］ Chen Y, Williams J, Ding I, et al. Radiation pneumonitis and early circulatory cytokine markers［J］. Semin Radiat Oncol, 2002,12(Suppl 1):26-33.