三七总皂苷部分逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞耐药性

【摘要】  目的： 研究三七总皂苷（PNS）对骨髓瘤细胞RPMI8226黏附及黏附诱导耐药的影响. 方法： 采用MTT法检测PNS和/或阿霉素（Adr）对RPMI8226细胞的毒性作用；荧光染料二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记并流式细胞术检测RPMI8226细胞与纤连蛋白（FN）黏附率. 结果： RPMI8226细胞与FN黏附2，12 h，其黏附率分别为(55.63±1.56)%，(65.42±2.46)%；经亚细胞毒浓度PNS（50 mg/L）预处理后，其黏附率分别降为(33.24±1.29)%,(34.16±1.59)%，处理前后差异有统计学意义（P<0.05）；FN黏附12 h后，瘤细胞对Adr的IC50值为（2.70±0.24） μmol/L，高于BSA对照组（2.03±0.13） μmol/L（P<0.05），经PNS处理后FN组Adr IC50值降至(1.08±0.09) μmol/L，与BSA对照组(0.82±0.07) μmol/L相比无统计学差异(P>0.05). 结论： PNS可降低RPMI8226细胞与FN的黏附率，并能部分逆转黏附介导的骨髓瘤耐药.

【关键词】  三七总皂苷 多发性骨髓瘤 RPMI8226 黏附 抗药性

    0引言

    多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种难以治愈的浆细胞恶性肿瘤，难治性的生物学基础是瘤细胞与细胞外基质（ECM）相互黏附介导的多药耐药形成（cell adhesion mediated drug resistance，CAM?DR）. MM细胞与ECM间相互黏附主要通过细胞表面的整合素（integrin）与其配体纤连蛋白（fibronectin, FN）结合. 体外实验证实，采用封闭性抗体阻断整合素与FN间的相互作用，瘤细胞与FN间的黏附性明显下降，其CAM?DR也得以完全或部分逆转［1］. 所以寻找高效低毒药物以下调MM细胞的黏附性，从而增加瘤细胞对化疗的敏感性具有重要意义. 中药三七总皂苷（panax notoginoside，PNS）能抑制血小板的黏附与聚集，进而发挥其活血化瘀功效［2］. 鉴于血小板的黏附、聚集与MM细胞的黏附有着类似的生物学过程，因此，PNS能否下调骨髓瘤细胞黏附性从而逆转黏附介导的肿瘤耐药值得进一步研究. 为此，我们以人MM细胞株RPMI8226细胞为材料，初步探讨PNS对MM细胞黏附性及CAM?DR的影响.

    1材料和方法

    1.1材料血塞通注射液源自昆明制药集团股份有限公司（每支含生药250 mg，主要成份为人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1，三七皂苷R1），-20℃分装冻存；注射用盐酸阿霉素（adriamycin，Adr）源自山西普德药业有限公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司. 四氮唑蓝（MTT），羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯［5(6)?carboxyfluorescein diacetate N?succinimidyl ester，CFSE］为Sigma产品；纤连蛋白（FN）为Becton Dickinson产品，注射用水溶解分装，-20℃冻存.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞来源于苏州大学免疫学教研室. 细胞培养于含100 mL/L热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于50 mL/L CO2，饱和湿度、37℃培养箱中悬浮培养，实验用细胞处于对数生长期.

    1.2.2MTT实验取对数生长期RPMI8226细胞按2.0×104/孔种入96孔板，根据预实验设PNS浓度为50，75，100，200，300，400，600，800 mg/L，在相同实验条件下，处理组中细胞分别加入不同浓度的PNS，每个浓度设3个平行孔，于加药后24 h检测，检测前每孔加入MTT溶液（5 g/L） 10 μL，37℃孵育4 h后，加入100 μL 100 g/L SDS（含0.01 mol/L HCl），充分溶解结晶物［3］，570 nm波长测定各孔A值，实验重复3次，取平均值，生长抑制率［（1-试验组A值/对照组A值)×100％］.

    1.2.3黏附实验用无菌过滤的TSM(20 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，2 mmol/L MgCl2，pH8.0)配制50 mg/L的FN及10 g/L BSA［4］，每孔50 μL分别包被96孔板，4℃过夜. 取对数生长期RPMI8226细胞（1.0×109/L），37℃，50 mL/L CO2条件下以2.5 mg/L CFSE标记30 min，加无血清RPMI1640液孵育12 h. CFSE标记细胞经非抑制浓度PNS（50 mg/L）预孵育2 h后，按细胞/2.0×104孔，种入96孔板. 实验分4组：① FN包被组；② BSA包被组；③ PNS+FN组；④ PNS+BSA组. 各组细胞分别37℃，50 mL/L CO2中培养2 h与12 h. 收集上清（含未黏附细胞），经流式细胞仪检测CFSE阳性细胞数. 细胞黏附率(%) =（1-上清液细胞数/总细胞数）×100%［5］.

    1.2.4PNS对RPMI8226细胞CAM?DR的影响FN与BSA包被处理同前. 对数生长期RPMI8226细胞经非抑制浓度PNS（50 mg/L）预孵育2 h后，按细胞2.0×104/孔，种入96孔板，黏附12 h，每孔分别加入不同浓度Adr（0.25，0.5，0.75 μmol/L），作用1 h，离心弃上清，加完全RPMI1640液培养24 h. 按MTT法测定生长抑制率(％)［6］. 实验分4组:① FN+Adr组；② BSA+Adr组；③ PNS+Adr+FN组；④ PNS+Adr+BSA组.

    统计学处理:用SPSS11.0软件进行处理，实验结果以x±s表示，组间均数比较用方差分析，两两比较采用LSD?t检验.

    2结果

    2.1PNS对RPMI8226细胞增殖的影响PNS对RPMI8226细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性，其24 h IC50值为(216.52±2.31) mg/L（图1）.

    图1不同浓度PNS对RPMI8226细胞增殖的影响

    2.2PNS对RPMI8226细胞黏附的抑制作用RPMI8226细胞黏附2 h，FN组黏附率(55.63±1.56)%高于PNS+FN组(33.24±1.29)%（P<0.05），PNS+FN组黏附率高于BSA组（9.56±0.85）%及PNS+BSA（9.01±0.76）%（P<0.05）；包被12 h，FN组黏附率略增加至(65.42±2.46)%，与其2 h黏附率相比无统计学差异（P>0.05），其余实验组12 h黏附率无统计学变化.

    2.3PNS逆转RPMI8226细胞CAM?DR经Adr作用24 h后，BSA对照组呈浓度依赖性凋亡，其IC50为（2.03±0.13） μmol/L；MM细胞与FN黏附后可以挽救Adr诱导的细胞凋亡，其IC50 （2.70±0.24） μmol/L，高于BSA对照组(P<0.05)；经50 mg/L PNS处理后，FN组RPMI8226细胞对Adr的敏感性提高，其IC50值降至(1.08±0.09) μmol/L，与BSA对照组IC50（0.82±0.07） μmol/L相比，无统计学差异（P>0.05），说明PNS能部分逆黏附介导的MM细胞耐药性.

    3讨论

    CAM?DR是多发性骨髓瘤难以治愈的主要生物学机制之一［7］. 筛选高效抑制瘤细胞黏附并且能逆转其CAM?DR的药物，已成为骨髓瘤领域的研究热点. PNS可以抑制ADP,花生四稀酸、血小板活化因子、凝血酶、胶原等诱导的血小板聚集；也可抑制内毒素诱导的粒细胞黏附分子的表达，进而降低白细胞与细静脉内皮之间的黏附性. PNS的抗细胞黏附、抗血小板聚集作用极可能为其化“瘀”功效的生物学机制之一. 鉴于MM细胞与胞外基质成分（如纤连蛋白等）之间的相互黏附也可部分理解为中医学的“瘀”症，故利用PNS的化“瘀”功效下调MM细胞的黏附性,以部分逆转黏附介导的MM耐药性就具有潜在的研究价值. 本实验证实,非抑制浓度PNS可显著抑制RPMI8226细胞对基质成分FN的黏附性，进而降低FN黏附组MM细胞对阿霉素的IC50值. 表明PNS能部分逆转MM细胞的CAM?DR，其效应机制可能与下调MM细胞与FN间的黏附性有关.

【】
  ［1］ Qing YW, Yao L, Tasato G, et al. Insulin?like growth factor I induces migration and invasion of human multiple myeloma cells［J］.Blood,2004,103(1):301-308.

［2］ 李兆健. 中药三七作用研究［J］. 上海中医药大学学报，1995,9(1):65.

［3］ Qiang YW, Kitagawa M, Higashi M, et al. Activation of mitogen?activated protein kinase through alpha 5/beta 1 integrin is required for cell cycle progression of B progenitor cell line, Reh, on human marrow stromal cells［J］. Exp Hematol, 2000,28(10):1147-1157.

［4］ Zhang Z, Rehmann H, Price LS, et al. AF6 negatively regulates Rap1?induced cell adhesion［J］. J Biol Chem, 2005,280:33200-33205.

［5］ 潘耀柱，陈协群，高广勋，等. 酪氨酸激酶抑制剂逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞的耐药性［J］. 实验血液学杂志,2006,14(2):267-270.

［6］ Damiano JS, Cress AE, Hazlehurst LA, et al. Cell adhesion mediated drug resistance(CAM?DR): Role of integrins and resistance to apoptosis in human myeloma cell lines［J］. Blood, 1999，93:1658-1667.

［7］ Hideshima T, Bradner JE, Wong J, et al. Small molecule inhibition of proteasome and aggresome function includes synergistic antitumor activity in multiple myeloma［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102:8567-8572.