肺微血管内皮细胞表型改变与博莱霉素所致大鼠肺纤维化的关系

【摘要】  目的: 观察博莱霉素所致肺纤维化大鼠微血管内皮细胞(LMVECs)超微结构及血清CTGF的变化，探讨肺微血管内皮细胞表型及与博莱霉素损伤肺纤维化间的关系. 方法: SD大鼠45只，随机分为3组：博莱霉素（BLM）组，肺炎链球菌组及正常对照组，每组15只，分别气管滴注博莱霉素及肺炎链球菌造模，对照组滴注生理盐水. 电镜观察外周肺组织内皮细胞超微结构，同时测定血清CTGF含量. 结果: 光镜及电镜显示肺炎组与BLM组的不同改变. 肺炎组组织学及肺微血管内皮细胞超微结构表现为典型的急性炎症损伤修复，之后肺组织结构恢复正常. BLM组表现为肺组织损伤的持续进行，肺微血管内皮细胞7 d开始增殖并出现形态学的改变，且贯穿实验各个阶段，最终胶原明显沉积于肺泡间隔. 血清CTGF测定：肺炎组3 d开始增高，第7 d骤降至(5.04±0.82) ng/L，第21 d恢复至(12.06±0.43) ng/L. BLM组全程增高，第7 d至(12.53±2.36) ng/L,第21 d增至高峰(19.45±0.41) ng/L. 结论: 肺微血管内皮细胞功能的转变及其分泌CTGF时相和量的异常可能是博莱霉素所致肺纤维化发生的重要环节.

【关键词】  博莱霉素 肺纤维化 内皮 血管 表型 结缔组织生长因子

    0引言

    急性肺泡炎是博莱霉素所诱发的肺纤维化（pulmonary fibrosis, PF）的早期病理变化之一，而急性肺泡炎与肺微血管及内皮细胞形态和功能的变化密切相关. 博莱霉素所诱发的PF的早期病理变化之一即为急性肺泡炎期. Beon等［1］证实，成纤维细胞过度增生和血管异常在硬皮病并发肺纤维化中起着重要作用，Magro等［2］的研究支持如下假设：微血管内皮损伤在人特发性肺纤维化的发生中其着一定作用. 上述研究表明，肺纤维化与肺微血管内皮细胞的损伤关系密切. 有关研究已经证实，结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）是微血管内皮细胞分泌的参与调节纤维结缔组织代谢的重要细胞因子［3］，而崔光彬等［4］的研究结果显示，博莱霉素损伤后肺微血管内皮细胞分泌的缝隙连接蛋白Cx43的表达下调. 显然，伴随肺微血管内皮细胞的损伤，其分泌的细胞因子也必然发生相应的改变. 但是，博莱霉素损伤后肺微血管内皮细胞形态和功能表型的变化与博莱霉素所诱发的肺纤维化发生间的关系尚不清楚. 我们采用博莱霉素（bleomycin, BLM）和肺炎链球菌分别建立肺纤维化和肺炎模型，通过对比观察肺微血管内皮细胞表型及其分泌的CTGF的变化，探讨肺微血管内皮细胞 (lung microvasular endothelial cells, LMVECs) 在博莱霉素所诱发的肺纤维化中的作用.

    1材料和方法

    1.1材料SD大鼠(第四军医大学实验动物中心）,体质量（150±20） g,雌雄不拘;注射用盐酸平阳霉素（天津太河制药）；JEM?2000EX透射电镜（日本JEOL）；大鼠CTGF定量ELISA试剂盒（尚柏生物医学技术有限公司）.

    1.2方法

    1.2.1动物模型的建立SD大鼠随机分为3组：BLM组、肺炎组、对照组，每组15只. BLM组：平阳霉素（8 mg/支），用9 g/L氯化钠稀释成4 g/L,SD大鼠［体质量（150±20） g］，气管内滴入平阳霉素溶液0.15~0.2 mL. 肺炎组在相同条件下向气管内注入肺炎链球菌菌液0.15 mL/只（药品生物制品检定所出品，细菌号31003，复苏繁殖2代，菌落数3×1011/L）. 对照组在相同条件下向气管内注入等量生理盐水.

    1.2.2光镜形态学观察分别于干预后的第3，7，14，21和28 d取各组大鼠肺组织. 具体为大鼠麻醉后开胸，于右心室注入生理盐水进行冲洗至肺发白后，取左右肺组织浸入40 g/L多聚甲醛固定液固定24 h，脱水后石蜡包埋. 行苏木精?伊红(HE)染色,光镜下观察其组织学特点，Van Gieson(VG)氏苦味酸性复红染色观察各组胶原纤维分布情况.

    1.2.3硝酸镧心内灌注及电镜观察分别于3，7，14，21和28 d取BLM组、肺炎组和对照组大鼠肺组织，大鼠麻醉后开胸，于左室流出道插入灌注针头，生理盐水200 mL冲洗后用40 g/L戊二醛二甲砷酸钠缓冲固定液（pH7.24～7.30）灌注固定. 取外周肺组织修切成1 mm3的小块，4 ℃镧醛固定液2 h，用含镧的0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗3次，10 min/次，再用不含镧的10 g/L四氧化锇后固定2 h，经0.2 mol/L二甲砷酸钠缓冲液冲洗后，梯度丙酮脱水，包埋，切片，固定后透射电镜观察.

    1.2.4大鼠血清CTGF测定分别于3，7，14，21和28 d取各组大鼠外周血，离心（4000 r/min，5 min）后取上清液-70℃冰箱保存. 采用ELISA法测定CTGF含量.

    统计学处理：计量结果以x±s表示，应用SPSS10.5软件，各组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）及LSD?t检验，P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1光镜观察

    2.1.1HE染色对照组肺泡结构完整，肺泡壁无增厚（图1A）；肺炎组3 d肺间质内见大量炎细胞，肺泡腔结构消失呈片状实变区（图1B）,7 d肺泡间隔变薄，肺通气较前好转，14 d后肺通气基本恢复正常，肺泡间隔可见少量胶原纤维；BLM组3 d肺泡腔渗出性改变，肺泡间隔炎细胞浸润，可见变性、坏死的上皮脱落，7 d肺组织实变明显（图2A），微小动脉内皮细胞增生,14~21 d肺泡间隔增厚明显，实变区明显增多，间质微小血管周围大量嗜酸性粒细胞浸润及少量巨噬细胞(图2B)，间质成纤维细胞增多（图2C），28 d肺泡间隔增厚，可见大量胶原纤维.

    A： 对照组肺泡结构完整，间质细胞排列整齐HE ×100； B: 肺炎组3 d组肺间质内大量炎细胞浸润，有片状实变区HE ×40.

    图1对照组及肺炎组HE染色

    A: 7 d组肺泡间隔增厚，有实变区; B: 14 d组间质实变明显，间质小血管周围大量中性粒细胞聚集; C: 21 d组肺间质内大量成纤维细胞.

    图2BLM组HE染色×100

    2.1.2VG染色对照组肺泡间隔可见少量极淡染红色胶原纤维（图3A）；肺炎组肺泡间隔见少量淡染红色胶原纤维（图3B）；BLM组肺泡间隔可见大量浓染条索状胶原纤维（图3C）.

    A: 对照组肺泡间隔极少量红色胶原纤维; B: 肺炎组肺泡间隔少量淡然红色胶原纤维; C: BLM组肺泡间隔大量浓染条索状红色胶原纤维.

    图3VG染色×100

    2.2电镜观察对照组： EC管腔面光滑，没有镧颗粒附着，细胞膜密度中等. 细胞器形态、密度未见异常，胞核扁平，异染色质聚集在核膜处，常染色质密度较低. 胞质内见较丰富的吞饮小泡. 基底膜呈连续线状，电子密度中等偏低. 肺炎组：3 d EC呈不同程度损伤表现，部分变性、坏死、脱落. 7 d EC管腔面有少量絮状镧颗粒，细胞膜电子密度增高. EC胞质厚度增加，由扁平形趋向于三角形、立方形，胞质内吞饮小泡明显减少. 细胞质电子密度显著增高，胞核常染色质增多，细胞呈增生状态. 部分EC坏死、脱落. 肺炎组14 d恢复光滑表面，未见镧颗粒附着，EC恢复正常状态，胞质内可见较丰富的吞饮小泡，EC旁有少量胶原沉积. BLM组：各时期EC管腔面可见球状、线状镧颗粒附着，部分区域可见血小板粘附于EC管腔面，EC腔内面可见多发的宽窄不等的绒毛样结构（图4A）. 细胞表面不光整，可见指状突起，EC呈增生状态（图4B）. EC胞质内吞饮小泡丰富（图4C），吞饮小泡体积增大，边缘电子密度增高. EC与Fb之间以一薄层基膜相连，EC与之相邻面可有较明显的吞饮小泡出现（图4D）. BLM组7 d在EC周可见少量胶原，且逐渐增多，至28 d EC周围出现大量胶原沉积.

    2.3血清CTGF含量肺炎组3 d CTGF高表达，7 d后恢复正常； BLM组3 d CTGF表达低于对照组，14 d后见一明显延迟高表达期（图5）.

    3讨论

    肺间质纤维化是以细胞外基质大量聚集为特征

    A: BLM 21 d组EC膜表面紧密粘着的物质，EC内见吞饮小泡较丰富×25 000; B: BLM 21 d组EC呈增生状态，细胞厚度增加，常染色质增多×10 000; C: BLM 7 d组EC管腔不光整，紧密连接开放，EC内见大量吞饮小泡，EC周围已有不规则胶原沉积×7500; D: BLM 7 d组EC与Fb仅一层基膜相隔，局部Fb胞质突起与EC直接接触，EC和Fb相邻面有多个吞饮小泡存在，Fb的内皮面还可见内吞形成的小凹×12 000.

    图4BLM组EC超微结构

    图5实验大鼠血清CTGF含量（n=15, ng/L, x±s）

    的慢性进行性疾病. BLM所诱发的肺损伤早期引起炎症反应，微血管内皮细胞是炎症损伤的中心反应器，它通过表型的改变及可溶性介质的分泌来控制血管骨架及通透性，调节凝血和血栓形成，并且介导炎细胞浸润，但BLM作用后伴随着（fibroblast, Fb）分裂、增殖，最终却形成了纤维化，这可能与不同损伤因子所引起的血管内皮细胞形态和功能变化有所差异有关. 现已证明血管内皮细胞是十分活跃的代谢及内分泌库，在许多病理情况下，如动脉粥样硬化等疾病均可导致内皮细胞结构和功能的改变，并且内皮细胞的改变起着重要的作用［5］. 本实验用HE及VG染色初步显示了在BLM和肺炎链球菌两种不同因素作用下，肺炎与纤维化组肺组织不同的病理变化过程，而电镜进一步显示了LMVECs在形态产生不同的改变. 肺炎组早期部分细胞变性坏死，其余LMVECs胞膜及胞质电子密度增高，核常染色质增多，细胞呈增生状态，之后恢复正常. 而BLM组各期LMVECs则表现为增生状态，LMVECs紧密连接开放，腔面可见血小板粘附,细胞不仅呈明显地增生状态，而且胞质吞饮小泡明显增多，吞饮小泡体积增大，边缘电子密度增高，局部EC的胞质与Fb的胞质突起直接接触. BLM作用后LMVECs基本形态及结构的改变均说明微血管内皮细胞由抗凝、抗粘附、舒张表型转化为促凝、促粘附、收缩表型，与姜莉等研究结果相符［6］. 相关研究表明，大分子蛋白的运输可通过小泡的形式跨内皮细胞转运至组织间隙发挥其生理效应［7］,并且细胞因子也可通过小泡的形式释放而发挥生理作用. 故本实验显示的LMVECs胞内吞饮小泡明显增多且体积增大也提示内皮细胞可能由“屏障功能”为主转变为“分泌功能”为主.

    纤维化的发生过程中，肌成纤维母细胞（myofibroblast, MFb）的持续存在是细胞外基质沉积的基础［8］，TGF?β具有促进Fb向MFb转化的作用，是致器官纤维化关键的细胞因子. 近年来，结缔组织生长因子与肺纤维化的关系引起关注，CTGF具有协同转化生长因子（TGF?β）促进MFb生长的作用，而CTGF的持续表达被认为是纤维化病变缓慢进展的重要因素［9-10］. Folger等［11］认为在器官纤维化的进程中CTGF可能通过作用于已活化的MFb促进纤维化的发生. 本实验通过ELISA法检测血清中CTGF的含量发现，在不同致病因素下CTGF分泌量及时相完全不同. 肺炎组早期增高，7 d时骤降，其后恢复正常，而BLM组CTGF早期无明显变化，自7 d后开始缓慢上升，14~21 d持续高峰水平，28 d降至正常，且峰值较肺炎组高. 说明BLM所致PF大鼠CTGF较肺炎组延迟高表达. CTGF是CCN基因家族成员之一，它最早发现于脐静脉内皮细胞［12］. 值得注意的是，实验组CTGF分泌的高峰期及时相变化特点与LMVECs胞质吞饮小泡增多期相符合，似乎提示BLM组微血管内皮细胞CTGF含量持续高水平及表达时相的差异与肺纤维化关系密切.

    总之，肺微血管内皮细胞通过一系列形态、功能及表型的变化参与了PF的进程，但是导致EC发生变化的分子机制如何，仍有待进一步探索.

【】
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