丙型肝炎病毒核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在HepG2细胞中的相互作用

【摘要】  目的： 使用哺乳动物双杂交系统探讨HCV?core与HCBP12在人肝癌细胞HepG2细胞中的相互作用. 方法： PCR分别扩增含HCV core及HCBP12的cDNA片段，克隆入pGEM?T载体，经测序正确后再分别克隆入哺乳动物双杂交的表达质粒PBIND和PACT中，并转染HepG2细胞，48 h后检测细胞中报告基因luciferase activity的表达水平. 结果： Dual?Luciferase Activety系统检测显示PBIND?core与PACT?HCBP12实验组萤火虫荧光与海肾素荧光的比值明显高于其他阴性对照组，但低于阳性对照组. 结论： 哺乳动物双杂交系统证实HCV核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在人肝癌细胞系中HepG2中有一定的相互作用，为进一步研究HCV?core和HCBP12的功能奠定基础.

【关键词】  肝炎病毒 病毒核心蛋白质类 HCBP12 哺乳动物双杂交系统 基因 报告

     0引言

    丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核心区位于HCV基因组的342～914 nt，其编码的核心蛋白由191个氨基酸组成，是最保守的HCV蛋白. 核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用［1］，临床和实验研究显示核心蛋白具有广泛的反式激活作用，与宿主蛋白相互作用，可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、的重要原因［2-3］. 我们以往应用酵母双杂交系统，以HCV核心蛋白为诱饵蛋白，在肝文库中筛选到HCV核心蛋白的相互作用蛋白，并命名为HCBP12，用免疫共沉淀技术证明HCV核心蛋白和HCBP12可以相互结合［4］，但是酵母双杂交系统和免疫共沉淀技术在验证蛋白质相互作用上都有一定的局限性［5］. 为研究HCBP12的功能，我们应用哺乳动物双杂交系统模拟真核动物体内环境，进一步证实HCV核心蛋白与HCBP12在HepG2细胞系中有相互作用，为研究HCBP12和HCV核心蛋白的功能奠定基础.

    1材料和方法

    1.1材料CheckMateTM Mammalian Two?Hybrid System，PureYield TMPlasmid Midiprep System，Dual?Luciferase Reporter Assay System（美国 Promega 公司）；克隆有HCV核心蛋白cDNA的质粒3.1?HCV core，32 a?HCBP12由本室保存；PCR Taq酶（北京鼎国生物有限责任公司）；DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶（大连宝生物公司）；玻璃奶DNA凝胶回收试剂盒，Lipofectamine2000（Invitrogen公司）；测序由上海生工公司完成，HepG2细胞本室；Turner BioSystems Veritas Microplate Luminometer（购自美国BIO公司）.

    1.2方法

    1.2.1用PCR扩增HCV核心蛋白(core)和HCBP12基因分别根据core基因和其最终载体PBIND的序列,设计克隆编码核心蛋白基因的引物为下游P1：5′?gATATCggTgAAgCgggCACA?3′；上游引物P2：5′?gATATCTTAggATgCCATgCCAAgCAg?3′；以质粒3.1?HCV core为模板，PCR反应条件为：94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环;HCBP12基因和其最终载体PACT,克隆编码HCBP12蛋白基因的引物为上游P1：5′?gTCgACTTATggTTgAgcTCATgTTCC?3′；下游引物P2：5′?gATATCTTAgTCTATTgggAggCCCAgC?3′；以32a?HCBP12为模板，PCR反应条件为：94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环.

    1.2.2PCR产物克隆及鉴定将纯化回收的目的core及HCBP12基因片段分别与pGEM?T载体在16℃条件下用T4 DNA连接酶连接过夜，转化入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，铺于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃孵育16 h. 挑取白色菌落行菌落PCR，碱裂解法提取阳性克隆质粒，分别命名为pGEM T?core及pGEM T?HCBP12，分别进行BamHⅠ/EcoRⅤ和SalI/EcoRⅤ双酶切鉴定. 证明目的基因片段已插入pGEM?T载体中后送生物公司测序进行分析. 测序显示正确后用BamHⅠ/EcoRⅤ从pGEMT?core克隆质粒上酶切目的基因片段core，用SalI/EcoRⅤ从pGEMT?HCBP12质粒上酶切目的基因片段HCBP12,10 g/L琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段.

    1.2.3构建及鉴定真核表达载体用BamHⅠ/EcoRⅤ双酶切表达载体PBIND，SalI/EcoRⅤ双酶切PACT，回收双酶切产物PBIND和PACT，载体片段与已经回收的要插入的插入片段core和HCBP12连接后转化大肠埃希菌DH5α，铺于含有氨苄青霉素的LB平板上37℃孵育18 h. 挑取白色菌落行菌落PCR，碱裂解法提取阳性克隆质粒，分别命名为PBIND?core及PACT?HCBP12，并分别用进行BamHⅠ/EcoRⅤ和SalI/EcoRⅤ双酶切鉴定,证明目的基因片段已插入真核表达载体中后,送生物公司测序进行分析. 测序正确后，应用转染级质粒提取试剂盒PureYieldTM Plasmid Midiprep System进行大规模的质粒提取和纯化.

    1.2.4转染HepG2细胞按双杂交系统说明于转染前1 d设计转染的样本，同时设阴性和阳性对照组. 共转染6组细胞，每组3个复孔，于24孔板培养平板的18孔每孔加500 μL不含双抗（氨苄和庆大霉素）的DMEM培养基，胰酶消化细胞，计数并接种18孔，细胞密度为1×105个/孔，可使转染当日细胞融合度达90%～95%. 对每个转染样本进行如下操作：① 在每孔中，提前用50 μL Opti?MEM稀释脂质体试剂2.0 μL，50 μL Opti?MEM稀释质粒DNA 8 μL, 3种需共转染的质粒比例分别为1∶1∶1，室温孵育5 min. ② 分别混合每孔的脂质体和DNA质粒，室温平衡20 min. ③ 在等待平衡的过程中，吸弃培养基DMEM,用冰预冷的1×PBS清洗2次. ④ 于18孔每孔加400 μL Opti?MEM. ⑤ 将质粒DNA与脂质体试剂的混合物缓慢逐滴均匀的加入每孔细胞，置37℃，50 mL/L O2孵箱培养6 h. ⑥ 6 h后，吸弃培养基，每孔缓慢滴入500 μL新鲜的完全培养基. ⑦ 转染48 h后，弃去细胞培养液，用1 mL冰预冷的PBS洗细胞3遍，小心吸弃PBS. ⑧ 加100 μl 1×Passive lysis buffer，室温在震荡器上轻晃15 min. ⑨ 将细胞溶解后产物，置于1.5 mL EP管中，4℃，15 000 g离心10 min. ⑩ 吸取上清20 μL上机检测.

    1.2.5报告基因表达的检测① 打开Turner Bio Systems Veritas Microplate Luminometer. 微孔板发光检测仪器，分别用双蒸水、700 mL/L，双蒸水、空气各清洗10次；② 按Dual?Luciferase Reporter Assay System说明操作，每EP管吸取上清20 μL加入96孔微孔测板. ③ STOP和Luc各3 mL接到相应的注射头，为每孔准备加入STOP和Luc各100 μL. ④ 开机启动Veritas检测程序.

    统计学处理:计量资料以x±s表示，数据分析采用SPSS11.5统计分析软件，采用方差分析和t检验，以P＜0.05为有统计学意义.

    2结果

    2.1核心蛋白及HCBP12基因片段编码区的扩增扩增出与预期大小一致的cDNA片段（图1）. 核心蛋白大小为573 bp，HCBP12大小为957 bp.

    2.2重组pGEM T?core质粒及pGEM T?HCBP12质粒的序列分析鉴定正确的pGEM T?core质粒及pGEM T?HCBP12质粒分别作正反方向的测序，序列分析表明所扩增的核心蛋白和HCBP12基因序列与Genbank中的HCV核心蛋白完全一致，与HCBP12序列比较，有个别碱基发生变异（图2）.

    A: HVC核心蛋白基因片段; B: HCBP12基因片段. 1： marker DL2000； 2： cDNA fragments.

    图1PCR扩增

    A: HCV核心蛋白PCR产物的测序结果与HCV core基因序列的比对; B: HCBP12 PCR产物的测序结果与HCBP12基因序列的比对.

    图2重组pGEM T?core质粒及pGEM T?HCBP12质粒的序列分析

    2.3重组PBIND?core及PACT?HCBP12质粒的酶切分析酶切片段与目的片段大小一致（图3）.

    A: 经BamHⅠ/EcoRⅤ双酶切的核心蛋白； B: 经双酶切SalI/EcoRⅤ酶切的HCBP12; M： marker DL2000.

    图3酶切鉴定

    2.4荧光素酶报告基因的检测与阴性对照组相比较，阳性对照组和实验组，质粒共转染各组荧光素酶活性/海肾素酶活性的比值明显增高（表1）. 表1质粒共转染各组荧光素酶活性/海肾素酶活性的比值组别

    3讨论

    哺乳动物双杂交系统的基本原理是基于真核生物转录因子含有两个功能域DNA结合部位（DNA?Bing Domain, DNA?BD）及转录因子激活部位（transcriptional activation, AD）.

    我们采用Promaga公司的哺乳动物双杂交系统，阳性对照组用已经证实在细胞内有表达而且有相互作用的两个蛋白Myod和Id的基因构建的真核转染载体［5］，转染细胞后用Dual?Luciferase Reporter Assay System检测萤火虫荧光与海肾素荧光的比值，通过比值的大小，把实验组与阴性和阳性对照组比较，可以间接地说明实验组两个真核载体转染细胞后，有无蛋白质的表达和蛋白质之间是否有相互作用［6］. 我们构建的实验组两个真核转染质粒PBIND?core和PACT?HCBP12转染HepG2细胞后，萤火虫荧光与海肾素荧光的比值明显较阴性对照组增加，与阳性组比较没有差异，间接说明在人肝癌细胞HepG2内有核心蛋白core和HCBP12的表达，两者间也发生了一定的作用,才引起萤火虫荧光的基因的报告增强.

    HCV核心蛋白是一个具有多种生物学功能的病毒蛋白，能够抑制细胞凋亡的启动，如下调p21启动子及p53活性［7］，这种作用与HCV持续感染及感染细胞无限增殖及肿瘤发生密切相关［8］，核心蛋白作为一种反式激活蛋白，不仅可以激活人类c?myc基因，IL?2和SV40早期启动子活性，也能够抑制T细胞增殖和IFN?γ的产生，阻碍机体对HCV感染肝细胞的清除，促使HCV感染慢性化及HCC的发生［9］.

    病毒编码的蛋白对宿主细胞基因表达的调节作用可能是HCV相关疾病发生的主要因素. HCV核心蛋白作为一种重要的转录激活因子，HCV感染的靶细胞的信号转导具有显著的影响，能够反式激活同源/异源病毒/细胞转录调节序列，使细胞功能发生改变，导致各种不良临床结局的发生［10］.

    HCBP12基因是本研究组通过酵母双杂交系统筛选出的与HCV核心蛋白相互作用的新蛋白（GeneBank AF395068）. 我们应用哺乳动物双杂交系统，模拟体内环境，证实了HCV core蛋白与HCBP12两者在人肝癌细胞HepG2细胞系中有某种程度的相互作用，因此，通过对HCBP12的细胞功能的研究，可能为进一步阐明HCV核心蛋白在细胞凋亡及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路，为对HCV发生机制和患者的奠定一定的基础.

【】
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