硬膜外间隙充填60 g/L羟乙基淀粉对大鼠脊髓和脊神经根的影响

【摘要】  目的： 观察硬膜外间隙充填60 g/L羟乙基淀粉对大鼠脊髓和脊神经根的影响. 方法： 硬膜外置管成功后的成年雄性SD大鼠24只，随机分成4组，每组6只. 除Ⅰ组不注入任何药物外，Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ组分别通过硬膜外导管注入生理盐水、60 g/L羟乙基淀粉、400 mL/L乙醇0.2 mL，1次/d，连续3 d. 测定体质量，夹趾试验和运动缺陷，1次/d，连续3 wk. 3 wk后灌注处死所有大鼠，取L1棘突以下的脊髓和脊神经根，在光镜和电镜下观察其病理改变. 结果： Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组相比，体质量增加值，夹趾试验和运动缺陷的差异无统计学意义（P>0.05）；Ⅳ组的体质量增加值明显少于Ⅰ,Ⅱ组，夹趾试验和运动缺陷的阳性率明显高于Ⅰ,Ⅱ组，差异有统计学意义（P<0.05 ）. 显微镜下，Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组脊髓和神经根组织结构未见明显异常；Ⅳ组部分脊髓和神经根神经纤维排列紊乱、髓鞘分离、水肿，个别运动神经元高尔基体扩张. 结论： 硬膜外间隙充填60 g/L羟乙基淀粉0.2 mL对大鼠脊髓和脊神经根无明显影响.

【关键词】  羟乙基淀粉 注射 硬膜外 脊髓 脊神经根

   0引言

    硬膜外自体血充填是硬膜穿破后头痛（PDPHA）的经典方法，但是目前自体血充填的安全性受到了质疑，因为它可以导致一些严重的并发症，如蛛网膜下腔出血［1］. 生理盐水、羟乙基淀粉以及右旋糖酐作为自体血的替代品已经用于硬膜外充填，然而关于它们对脊髓和脊神经根有无影响尚无定论. 我们拟观察硬膜外间隙充填60 g/L羟乙基淀粉对脊髓和脊神经根的影响，探讨其作为硬膜外充填物的安全性.

    1材料和方法

    1.1材料成年雄性SD大鼠，体质量250～300 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供. 硬膜外置管成功后的大鼠24只，测体质量并随机分成Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ组，每组6只. 除Ⅰ组不注入任何药物外，Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ组分别通过导管注入生理盐水（Ⅱ组），60 g/L羟乙基淀粉（Ⅲ组），400 mL/L乙醇（Ⅳ组）0.2 mL，1次/d，连续3 d. 60 g/L羟乙基淀粉（羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液）为德国费森尤斯卡比公司产品.

    1.2方法腹腔注射100 g/L水合氯醛300 mg/kg麻醉后背部除毛，用750 g/L乙醇消毒，操作过程中用60 mL注射器横垫在腹部使腰椎充分弯曲. 沿中线于T13 ?L1棘突间切开皮肤，打开筋膜，切开T13与L1的棘间韧带并分离棘突两侧肌肉，暴露T13与L1棘突间隙. 仔细分离此间隙上下的筋膜和肌肉组织，小心地分离出椎板间孔. 剪掉T13棘突，用止血钳夹住L1棘突并往上提，经椎板间孔插入自制的硬膜外导管，沿脊柱方向轻柔地向尾端置入2 cm，固定导管，青霉素钠粉涂抹，缝合肌肉，并作皮下隧道将导管另一端引出于颈背部，外露1.5 cm固定.

    待大鼠麻醉完全清醒后通过导管缓慢注入20 g/L利多卡因0.1 mL，如果大鼠后肢瘫痪而前肢运动正常则说明导管位于硬膜外间隙；若大鼠出现呼吸困难，死亡或后肢未瘫痪则说明导管位置异常，此大鼠被舍弃. 连续3 d观察大鼠步态、脊柱外形和感觉运动功能，若大鼠出现以上任何一方面的异常，则舍之不用. 置管后第4日通过硬膜外导管给药，除Ⅰ组不注入任何药物外，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ组分别注入生理盐水、60 g/L羟乙基淀粉、400 mL/L乙醇0.2 mL，1次/d，连续3 d. 给药完毕后再次测试导管位置，测试后拔除导管.

    1.2.1观察指标大鼠的体质量增加值；饮食及活动能力，夹趾试验和运动缺陷［2］；脊髓和脊神经根的光镜电镜结果.

    1.2.2取材及病观察3 wk后，100 g/L水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，开胸从左心室插管至升主动脉，先用生理盐水灌注，待大鼠肝脏变白后用30 g/L多聚甲醛，20 g/L戊二醛磷酸固定液灌注、处死. 以L3脊神经根为中心完整取下L1棘突水平以下的脊髓和脊神经根. 每组取5只标本放在40 g/L多聚甲醛磷酸缓冲液中固定48 h后，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察脊髓和脊神经根形态学变化. 另1只标本放在25 g/L戊二醛磷酸缓冲液中固定后行透射电镜观察脊髓和脊神经根超微结构的变化.

    统计学处理：采用SPSS13.0统计软件包对数据进行分析. 计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用Fisher精确概率法，多重比较采用LSD?t检验. P<0.05表示差异有统计学意义.

    2结果

    2.1体质量增加值四组间大鼠最初体质量的差异无统计学意义（P>0.05）. 注药后3 wk，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组间的体质量增加值无统计学意义（P>0.05）；Ⅳ组的体质量增加值明显小于Ⅰ组和Ⅱ组，差异均有统计学意义（P<0.05，表1）.表1各组大鼠体质量及体质量增加值

    2.2行为学表现Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ组大鼠试验期间饮食能力及活动正常，夹趾试验及运动缺陷试验均阴性（P<0.05）；Ⅳ组大鼠均有明显的食欲和活动下降，夹趾试验阳性率为100％，运动缺陷试验阳性率为50％，差异有统计学意义（P<0.05).

    2.3病理学结果光镜下：Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组脊髓和神经根的横切面中，脊髓和神经根结构完整清晰. 灰质内神经元形态正常，细胞膜完整，胞核清晰可辨，白质内神经纤维排列整齐，细胞间基质均匀(图1A)；脊神经根神经纤维形态正常，排列有序，胶质细胞未见明显异常(图1B). Ⅳ组脊髓灰质内神经元未见明显病理改变，白质后索轻度排列紊乱、水肿(图1C)；脊神经根神经纤维水肿，髓鞘分离，脱髓鞘明显(图1D).

    A: Ⅲ组大鼠脊髓HE ×200; B: Ⅲ组大鼠脊神经根HE ×400; C: Ⅳ组大鼠脊髓HE ×200; D: Ⅳ组大鼠脊神经根HE ×400.

    图1光镜下的病结果

    电镜下：Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组脊髓后角神经元细胞膜完整, 细胞核大，核仁明显，粗面内质网成堆、线粒体、高尔基体、溶酶体等细胞器均清晰可见(图2A)；脊髓神经纤维轴索排列成束，轴索内线粒体双层囊膜与板层排列的嵴均清晰可见，轴突内微丝排列密集，走形规则(图2B)；脊神经根髓鞘均发育良好，密度均等，轴突内微丝排列密集，走形规则，线粒体丰富，嵴清晰(图2C). Ⅳ组脊髓后角运动神经元细胞膜完整, 细胞核大，核仁明显，高尔基体扩张，其余细胞器清晰无明显异常(图2D)；部分脊髓神经纤维排列紊乱，髓鞘分离，轴索无明显病理改变(图2E)；脊神经根髓鞘大多数明显水肿，髓鞘分离，轴索无明显病理改变(图2F).

    A: Ⅲ组大鼠脊髓运动神经元；B: Ⅲ组大鼠脊髓神经纤维; C: Ⅲ组大鼠脊神经根; D: Ⅳ组大鼠脊髓运动神经元; E: Ⅳ组大鼠脊髓神经纤维; F: Ⅳ组大鼠脊神经根.

    图2电镜下的病理学结果

    3讨论

    药物的神经毒性是评审椎管内药物安全性的重要指标. 60 g/L羟乙基淀粉虽已应用于硬膜外间隙的充填，但对其神经毒性的研究仍然很少. 因此，我们以硬膜外间隙充填60 g/L羟乙基淀粉的安全性作为研究目的，同时选取神经毒性较强的乙醇作为阳性对照.

    我们选择T13?L1间隙向尾端置管2 cm，导管尖端可达大鼠的L3?L4间隙，此位置在人类相当于L2?L3间隙. 通过导管的另一端注入20 g/L利多卡因0.1 mL来检测导管位置，0.1 mL相当于成人的15 mL. 给药完毕后再次测试导管位置，避免了由于导管在3 d的给药期间移出硬膜外间隙而造成的试验结果偏差. 大鼠单次硬膜外注射20 g/L利多卡因0.1 mL不会引起明显的神经毒性［3］.

    硬膜外间隙给药的神经并发症发生率远远低于蛛网膜下腔［4］给药. 近年有研究报道大鼠鞘内分别注入右旋糖酐40和聚明胶肽未见脊髓损伤及全身毒性的表现［5］. 但是，鞘内给药与临床上采用的硬膜外间隙给药的方式相差甚远，而且给药剂量和给药间隔也不能与临床相似. 我们成功复制了大鼠硬膜外间隙给药的模型，并且模拟临床的给药剂量，每次0.2 mL，连续给药3次. 0.2 mL相当于成人硬膜外间隙容量的1/3，加上小动物的硬膜比人类硬膜具有更强的通透性［6］，因此，我们认为大鼠硬膜外充填60 g/L羟乙基淀粉0.2 mL足够评估其对神经的毒性作用.

    药物的神经毒性可以表现为组织学、生理学或者行为学的改变，有的则仅仅为行为学变化而没有组织学变化［7］，因此我们还观察了大鼠食欲、活动、感觉和运动的改变.

    本研究结果表明硬膜外间隙充填60 g/L羟乙基淀粉0.2 mL对大鼠脊髓和脊神经根无明显影响. 此研究结果可能与60 g/L羟乙基淀粉的理化性质有关. 60 g/L羟乙基淀粉的主要成分由羟乙基化和水解工艺粘玉米淀粉制成，而粘玉米淀粉与人体糖原很相似；其他成分（氯化钠、氢氧化钠、盐酸、注射用水）都是人体血浆中存在的正常物质；其分子渗透压308 mosm/L与血浆等渗，pH4.0~5.5. 此外，硬膜外间隙的充填剂量一般为硬膜外容量的1/4～1/3，充填的剂量不大或许也是60 g/L羟乙基淀粉对脊髓和神经根无毒性的原因之一. 同时，本实验观察到乙醇组脊神经根和脊髓白质后索病变较严重，而脊髓白质其他索和灰质均无明显改变，说明乙醇对脊神经根和脊髓的损伤机制主要是直接浸润.

【】
  ［1］ Das RR, Michaelides C, San Luciano M, et al. Accidental intrathecal injection of epidural blood patch with extensive subarachnoid dissemination of blood and vertebrobasilar vasospasm: A case report［J］. J Neurol Sci,2005,238(1):497.

［2］ Bajrovic F, Sketelj J. Extent of nociceptive dermatomes in adult rats is not primarily maintained by axonal competition［J］. Exp Neurol,1998,150:115-121.

［3］ Muguruma T, Sakura S, Saito Y. Epidural lidocaine induces dose?dependent neurologic injury in rats［J］. Anesth Analg,2006,103(4):876-881.

［4］ Auroy Y, Narchi P, Messiah A, et al. Serious complications related to regional anesthesia: Results of a prospective survey in France［J］. Anesthesiology,1997,87(3):479-486.

［5］ Chanimov M, Berman S, Cohen ML, et al. Dextran 40(Rheomacrodex) or Polygeline(Haemaccel) as an epidural patch for post dural puncture headache: A neurotoxicity study in a rat model of Dextran 40 and Polygeline injected intrathecally［J］. Eur J Anaesthesiol,2006,23(9):776-780.

［6］ Hogan QH, Stadnicka A, Stekiel TA, et al. Mechanism of mesenteric venodilation after epidural lidocaine in rabbits［J］. Anesthesiology,1994,81:939-945.

［7］ Svensson BA, Alari L, Post C. Repeated intrathecal injections of dezocine produce antinociception without evidence for neurotoxicity in the rat: A study of morphometric evaluation of spinal cord histology［J］. Anesth Analg,1992,75:392-399.