雷帕霉素对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和NO分泌的影响

【摘要】  目的： 观察雷帕霉素对大鼠骨髓来源内皮祖细胞（EPC）增殖、凋亡及一氧化氮（NO）分泌的影响. 方法： 密度梯度离心法获得SD雄性大鼠的骨髓EPCs，无菌条件下培养6 d；实验分为5组：对照组及不同浓度（0.1, 1.0,10,100 μg/L）雷帕霉素组. 各组皆于24 h后收集标本，MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞凋亡率，硝酸还原酶法检测培养液中的NO含量. 结果： 与对照组相比，1.0~100 μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs增殖及NO分泌，并诱导EPCs凋亡（P<0.05），具有浓度依赖性. 结论： 1.0~100 μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs的增殖及NO分泌，并诱导EPCs凋亡.

【关键词】  雷帕霉素 内皮祖细胞 细胞增殖 凋亡 一氧化氮

　　0引言

　　近年来经皮腔内冠状动脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI）广泛用于冠心病的非药物治疗，但较高的再狭窄率（达20%～30%）严重影响手术疗效. 研究发现，内皮损伤及功能失调是再狭窄发生的启动因素，促进内皮恢复已成为预防PCI术后再狭窄的新策略［1］. 内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)是一种起源于骨髓的原始细胞,以CD133,CD34,VEGF?R2等为标志，具有内皮系分化潜能，在一定条件下可定向分化为成熟的内皮细胞，参与损伤血管内皮的修复，并可以促进支架内皮化，对预防PCI后再狭窄具有重要意义［2］. 近来有研究发现，一定浓度的雷帕霉素可抑制EPC的分化、增殖及迁移，降低EPC内皮一氧化氮合酶mRNA 的表达［3-5］. 作者拟观察雷帕霉素对EPC增殖、凋亡及NO分泌能力的影响，旨在为药物洗脱支架的内皮化延迟提供实验依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料雄性SD大鼠，体质量（100±5） g，由第四军医大学实验动物中心提供. 试剂和材料：Ficoll淋巴细胞分离液购自医学院生物工程医学研究所，胎牛血清为Hyclone产品；M199为Gibco产品，血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）为美国CYTOLAB产品，雷帕霉素购自福建科瑞药业有限公司，NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所， DiI?ac?LDL为美国invitrogen公司产品，FITC?UEA?I为美国Sigma产品；ApoAlertTM AnnexinV凋亡检测试剂盒为美国Clontech公司产品. 仪器有： 荧光显微镜（Leica），倒置相差显微镜（Olympus），离心机（Sorvall），酶联免疫检测仪（美国Bio?RAD公司），Elite ESP型流式细胞仪（美国COULTER公司），UV22450分光光度计（日本SHIMADZU公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1大鼠骨髓EPC的分离颈椎脱臼法处死大鼠，无菌条件下取出四肢长骨，750 mL/L酒精内浸泡5 min，用含肝素的培养液冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，以1∶2的比例叠加到Ficoll淋巴细胞分离液上，保持液面清晰，离心（2000 r/min）20 min，小心吸取中间云雾状单核细胞层，5倍体积 M199重悬，离心（1500 r/min）10 min，洗涤两次后弃上清，用含胎牛血清（100 mL/L），VEGF（10 μg/L）及bFGF（10 μg/L）的 M199重悬细胞，调整浓度为4×108/L，接种于培养瓶中，取4 h未贴壁的细胞，在37℃，50 mL/L CO2条件下培养.

　　1.2.2EPC的表型鉴定将培养6 d的细胞与DiI?ac?LDL(2.4 μg/mL) 37℃下孵育1 h，然后用40 g/L多聚甲醛固定10 min. PBS液浸洗后将FITC?UEA?I (10 μg/mL)加于上述标本，37℃下孵育1 h. 用荧光显微镜进行鉴定，DiI?ac?LDL和FITC?UEA?I 染色双阳性细胞为正在分化的EPCs.

　　1.2.3实验分组细胞培养6 d后，用2.5 g/L胰蛋白酶、0.2 g/L乙二胺四乙酸消化，全培养液重悬呈单细胞悬液后，分别接种于96孔培养板（以1.5×104细胞/孔的密度）及培养瓶（以5×105细胞/瓶的密度）. 实验分为5组：对照组（仅加入全培养液）及不同浓度雷帕霉素（0.1，1.0，10，100 μg/L）组. 各组皆于24 h后收集标本.

　　1.2.4MTT比色法检测细胞增殖96孔培养板收集的各组标本，每孔加浓度为5 g/L的MTT溶液20 μL，在37℃，50 mL/L CO2孵箱中继续孵育4 h；终止培养，吸弃上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上490 nm波长处测定各孔吸光度（A490），用只加培养液不加细胞的空白孔调零.

　　1.2.5流式细胞仪双标法检测细胞凋亡率各组细胞用0.01 mol/L PBS冲洗，1.25 g/L胰蛋白酶消化收集细胞；离心去除固定液，用含血清培养液洗1遍，用ApoAlertTM AnnexinV凋亡检测试剂盒染色，5×105细胞用1×Binding buffer漂洗1次；细胞重悬于200 μL 1×Binding buffer. 加入Annexin V 5 μL和碘化丙啶（PI）10 μL，室温避光10～20 min，上机（流式细胞仪）测试. Annexin V+/PI-细胞数量代表凋亡细胞数量.

　　1.2.6NO水平测定采用硝酸还原酶法. 每孔吸取上清100 μL，按试剂盒说明书检测各孔上清NO水平.

　　统计学处理:实验重复8次，数据以x±s表示. 应用SPSS10.0进行统计分析，采用单因素方差分析（One?Way ANOVA）及LSD?t检验，P<0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1细胞形态观察与表型鉴定细胞培养第4 d，倒置相差显微镜观察细胞成多角形；DiI?ac?LDL与FITC?UEA?I双染后，经激光共聚焦显微镜观察显示，90%以上的细胞呈现DiI?ac?LDL和FITC?UEA?I双阳性表达（桔黄色），为正在分化的EPCs（图1）.

　　图1激光共聚焦显微镜检测细胞表面标志（略）

　　2.2雷帕霉素对EPCs增殖、凋亡的影响与对照组相比，1.0~100 μg/L的雷帕霉素可显著抑制EPCs增殖，诱导EPCs凋亡（P<0.05），具有浓度依赖性（随雷帕霉素浓度增加而作用增强,表1).

　　2.3雷帕霉素对EPCs NO分泌的影响与对照组相比，1.0~100 μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs的NO分泌（P<0.05），呈浓度依赖性，即随雷帕霉素浓度增加而作用增强(表1).

　　表1雷帕霉素对EPCs增殖、凋亡及NO分泌的影响（略）

　　aP<0.05 vs 对照； cP<0.05 vs 雷帕霉素0.1 μg/L; eP<0.05 vs 雷帕霉素1.0 μg/L; gP<0.05 vs 雷帕霉素10 μg/L.

　　3讨论

　　内皮损伤及功能失调是PCI术后再狭窄发生的启动因素，促进内皮恢复已成为预防PCI术后再狭窄的新策略［1］. 既往认为，受损内膜的再内皮化主要由损伤周边内皮细胞增殖、迁移修复. 近年研究表明，骨髓来源EPC的动员与分化在PCI术后内皮恢复中起着非常重要的作用［2］.

　　研究发现，低浓度雷帕霉素对血管内皮细胞增殖抑制作用较弱，不影响内皮细胞迁移. 但一定浓度的雷帕霉素可抑制EPCs分化、增殖及迁移，降低EPCs内皮一氧化氮合酶mRNA的表达，减少NO的释放［3-5］. 因此，雷帕霉素可能通过抑制EPC数量及功能而减弱EPC对损伤内皮的修复能力，参与晚期支架内血栓的发生. 本研究观察了雷帕霉素对大鼠骨髓来源EPCs增殖、凋亡及NO分泌的影响，发现，1.0~100 μg/L的雷帕霉素可抑制EPCs的增殖及NO分泌并诱导EPCs凋亡，呈浓度依赖性，即随雷帕霉素浓度增加而作用增强；这可能是雷帕霉素抑制血管内支架置入术后内皮修复的机制之一.  结果提示应用雷帕霉素药物洗脱支架防止血管成形术后再狭窄的同时，也阻抑了骨髓源性EPC参与损伤内皮的修复，这可能是导致迟发性支架内血栓形成的重要原因之一. 因此，应用雷帕霉素药物洗脱支架需警惕其对血管再内皮化的负面影响，适当延长抗凝药物的应用时间；另外，以EPC为靶向的干预措施可能更有助于促进支架的再内皮化.

【】
  　　［1］ Kipshidze N, Dangas G, Tsapenko M, et al. Role of the endothelium in modulating neointimal formation: vasculoprotective approaches to attenuate restenosis after percutaneous coronary interventions［J］. J Am Coll Cardiol,2004，44(4):733-739.

　　［2］ Inoue T, Sata M, Hikichi Y, et al. Mobilization of CD34?positive bone marrow?derived cells after coronary stent implantation: impact on restenosis［J］. Circulation, 2007,115(5):553-561.

　　［3］ Butzal M, Loges S, Schweizer M, et al. Rapamycin inhibits proliferation and differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro［J］. Exp Cell Res, 2004,300(1):65-71.

　　［4］ Miriuka SG, Rao V, Peterson M, et al. mTOR inhibition induces endothelial progenitor cell death［J］. Am J Transplant, 2006,6(9):2069-2079.

　　［5］ 张坡，黄岚，朱光旭，等. 雷帕霉素对内皮祖细胞增殖、黏附及迁移能力影响的实验研究［J］. 中华心血管病杂志，2006，34（11）：1021-1025.