邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤SOSP?9607细胞作用及机理研究

【摘要】  目的: 研究邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素（ODE）抗骨肉瘤SOSP?9607细胞作用及机理. 方法: 采用MTT比色法测定体外抗骨肉瘤SOSP?9607细胞作用，透射显微镜观察细胞凋亡形态学；采用激光共聚焦显微镜测定SOSP?9607细胞内［Ca2+］,［Mg2+］, pH值和线粒体膜电位（MMP）的荧光强度；免疫细胞化学技术检测细胞内Bc1?2和Bax表达. 结果: ODE时间、浓度依赖性地抑制SOSP?9607细胞生长，诱导细胞凋亡具有典型的凋亡形态特征如细胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂等；剂量依赖性地增加SOSP?9607细胞内Ca2+， Mg2+浓度而降低细胞内pH值和线粒体膜电位；使SOSP?9607细胞内Bcl?2蛋白表达下降而Bax蛋白表达增加. 结论: 邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素在体外实验中能明显抑制骨肉瘤SOSP?9607细胞生长，其作用机制可能与改变细胞内环境稳态及Bcl?2和Bax蛋白表达而诱导细胞凋亡有关. 
【关键词】  邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素 骨肉瘤 肿瘤细胞 凋亡 线粒体膜电位 bcl?2蛋白 Bax蛋白
　　0引言
　　骨肉瘤是起源于骨组织的最常见的恶性肿瘤，又称成骨肉瘤，任何年龄均可发病，而以15～25岁青少年居多. 是原发性恶性骨肿瘤中最常见，恶性程度最高的骨肿瘤，有早期发生远处转移(易发生肺转移)的特点，预后不良. 通常认为，骨肉瘤只要明确诊断，尚无肺转移，应施行高位截肢术或关节离断术，若合并单一肺转移源者可同时施行截肢术和肺转移源切除术. 但是，骨肉瘤恶性程度高，截肢等破坏性手术后，生存机会从未超过20%，且骨肉瘤截肢术后80%以上患者均会出现肺转移［1-3］，基于这样的事实，目前骨肉瘤之强调早期综合治疗. 在早期综合治疗的措施中，由于骨肉瘤对放射治疗不敏感，仅用于手术前、后之辅助治疗，或肿瘤不能切除或肺转移时应用. 所以骨肉瘤早期综合治疗措施以手术和化疗为主. 这就促使了众多的学者寻找有效的抗骨肉瘤药物，试图通过化疗以期改善骨肉瘤患者的预后.
　　鬼臼是一传统的抗肿瘤中草药，其衍生物VP16，VM26已成功用于临床，对多种肿瘤显示出良好的效果［4-5］，被认为是最有效、最有希望的抗骨肉瘤药物. 但由于其溶解度差，生产工艺复杂，毒性高等原因限制了其广泛应用. 新近发现鬼臼毒类衍生物有很强的抗氧化、清除自由基作用，此作用与其抗肿瘤作用相关［6-7］. 因此，鬼臼成为最有希望研发高效低毒抗骨肉瘤新药的领域. 据此我们将研究新鬼臼毒类衍生物邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤作用，并初步探讨其机理.
　　1材料和方法
　　1.1材料邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素由兰州大学化工学院田瑄教授惠赠，用50 g/L DMSO溶解；RPMI 1640为GIBCO公司产品；新生小牛血清为杭州四季青生物有限公司产品，室温溶化后置56℃水浴灭活30 min，无菌分装密封后置-20℃冰箱冷冻保存备用；胰蛋白酶（Trypsin, Try）∶Difco 1∶250，上海化学试剂站分装厂产品，用无Ca2+，Mg2+的D?Hanks配成2.5 g/L溶液；四甲基偶氮唑盐［3?(4,5?dimethylthiazol?2?yl)?2,5?diphenyl?tetrazolium bromide, MTT］为Sigma公司产品，用0.01 mol/L PBS（pH为7.2）配成5 g/L（临时现配）；十二烷基硫酸钠 (Sodium dodecyl sulfate, SDS)为Sigma公司产品，用0.01 mol/L盐酸配成100 g/L的酸化SDS溶液，室温保存备用；Fluo?3/AM, Mag?Fluo?4/AM, Carboxy SNARF?1/AM and Mito Tracker Green FM探针为Molecular Probes Co. (Eugene, Oregon, USA)产品. 鼠抗人Bcl?2单克隆抗体（Clone：Bcl?2），鼠抗人Bax单克隆抗体（Clone：2D2）为Zymed labortrory 产品，均1∶100稀释. Histostain?Plus Kit(抗小鼠免疫组化试剂盒，LHK611)为晶美公司产品.
　　1.2方法
　　1.2.1细胞株及培养成骨肉瘤SOSP?9607细胞株由第四军医大学唐都全军骨肿瘤研究所实验室引进. 细胞株用含体积分数为100 mL/L的小牛血清、2 mmol/L L?谷氨酰胺（L?Gln）,1×105 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640完全培养液，在37℃，50 mL/L CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养. 传代时先用2.5 g/L胰蛋白酶（Try）消化2~4 min，倾弃Try，再用培养液将细胞吹打制成单细胞悬液传代，每2~3 d传代一次，取对数生长期细胞用于实验.
　　1.2.2邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP?9607细胞生长的抑制作用取对数生长期SOSP?9607细胞并制成2×108 细胞/L单细胞悬液，每孔90 μL接种于96孔培养板，实验组分别加入不同浓度的ODE（终浓度6.25~200 mg/L），对照组加入等量溶媒（终浓度5 g/L DMSO），调零孔加不含细胞的完全培养液100 μL，每组设四个复孔. 在37℃，50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱中培养，培养结束前4 h每孔加入5 g/L MTT 10 μL，继续培养4 h后每孔加入细胞裂解液100 g/L SDS 100 μL终止反应，过夜，振荡摇匀后，全自动酶联免疫检测仪（ELx800型，美国Bio?TEK产品）测定各孔在570 nm波长的A值，读取4孔A值并求其平均值，并药物对肿瘤细胞的抑制率. 细胞抑制率（IR%）=（1-A药物组/A对照组）×100%
　　1.2.3透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM）检测SOSP?9607细胞凋亡形态学变化将对数生长期SOSP?9607细胞以1×108/L的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度ODE，对照组加入等量溶媒（终浓度5 g/L DMSO），培养24 h后，收集细胞，PBS液洗3次，弃上清液，用30 g/L戊二醛固定液连续固定2次，每次30 min，10 g/L锇酸4℃固定2 h，然后分别用500, 700, 90 mL/L的丙酮各脱水15 min，1000 mL/L丙酮脱水45 min. 浸入1∶1丙酮包埋剂混合液，置室温下1 h. 浸入包埋剂37℃过夜. 60℃固化48 h，降温后保存于干燥器内. 钻石刀将选定区域修成电镜切片团块，超薄切片机切片后贴于铜网上进行观察.
　　1.2.4激光共聚焦显微镜测定SOSP?9607细胞内［Ca2+］, ［Mg2+］, pH值和线粒体膜电位（MMP）的荧光强度SOSP?9607细胞以2×108/L的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度ODE，对照组加入等量溶媒，每组3瓶，培养24 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，PBS液洗涤3次，每瓶细胞分为4份，根据分子探针说明书在37℃避光条件下分别应用Fluo?3/AM(5 μmol/L), Mag?fluo?4(5 mmol/L), Carboxy SNARF?1/AM(10 μmol/L)和Mito Tracker Green FM(1.25 μmol/L)负载细胞，孵育45 min后用PBS液洗涤2~3次，制备细胞悬液滴片，用激光共聚焦显微镜测定细胞内［Ca2+］, ［Mg2+］， ［H+］和MMP荧光强度.
　　1.2.5免疫细胞化学方法（Immunohistochemistry, IHC）观测SOSP?9607细胞内Bcl?2, Bax蛋白表达变化将对数生长期SOSP?9607细胞以1×108/L的浓度接种于培养瓶，加入不同浓度ODE，对照组加入等量溶媒（终浓度5 g/L DMSO），培养24 h后，收集细胞，预冷PBS液洗3次，涂片，立即风干，冷丙酮饱和湿度固定，PBS漂洗，加30 mL/L H2O2?甲醇液以消除内源性过氧化氢酶的作用，PBS漂洗，加试剂A(山羊血清), 室温饱和湿度孵育10 min，弃去山羊血清，加100 μL适量一抗，4℃饱和湿度过夜孵育，PBS漂洗，加试剂B(抗小鼠生物素化二抗)，室温饱和湿度孵育10 min，PBS漂洗，加试剂C（HRP标记链亲和素），室温饱和湿度孵育10 min，PBS漂洗，加DAB显色液室温显色（时间以镜下观察为准），自来水充分冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜检（阳性部位应显棕黄或棕褐色）.
　　统计学处理： 实验结果用x±s表示. 组间比较用方差分析及Dunnett?t检验,P<0.05为有统计学意义.
　　2结果
　　2.1邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP?9607细胞生长的抑制作用MTT比色法检测结果（表1）显示邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP?9607细胞生长有明显的抑制作用，邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素作用24 h抑制SOSP?9607细胞生长的最低有效量为25 mg/L，抑制率为14.8%，抑制作用随浓度的增加而增加，200 mg/L的抑制率为45.0%；作用48 h时抑制作用进一步增强，最低有效量为6.25 mg/L，6.25~200 mg/L ODE对SOSP?9607细胞生长的抑制率依次为15.4%，25.9%，36.4%，49.9%，61.9%和74.7%，IC50为50.0 mg/L，说明ODE能时间、浓度依赖性地抑制SOSP?9607细胞生长.
　　表1ODE抗骨肉瘤 SOSP?9607细胞作用（略）
　　aP<0.05, bP<0.01 vs 对照.
　　2.2邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP?9607细胞凋亡形态学的影响与对照组比较，实验组SOSP?9607细胞出现明显的凋亡形态学变化：细胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂及空泡等（图1）.
　　2.3邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP?9607细胞内［Ca2+］， ［Mg2+］， pH值和线粒体膜电位的影响ODE剂量依赖性的增加SOSP?9607细胞内Ca2+浓度，200 mg/L时较空白对照增加3.16倍. 同时，ODE也剂量依赖性的增加SOSP?9607细胞内Mg2+浓度(表2).
　　ODE能剂量依赖性的降低SOSP?9607细胞内pH值，以100 mg/L作用最为明显，抑制率为64.1%；同样，ODE也剂量依赖性的降低SOSP?9607细胞线粒体膜电位，200 mg/L的作用最为明显，抑制率为40.2%.
　　A: 对照; B: ODE 50 mg/L.
　　图1ODE对骨肉瘤SOSP?9607细胞凋亡特征的影响×6000（略）
　　表2ODE对骨肉瘤SOSP?9607细胞内Ca2+, Mg2+浓度, pH值和MMP的影响（略）
　　aP<0.05, bP<0.01 vs 对照.
　　2.4邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素对SOSP?9607细胞内Bcl?2， Bax蛋白表达的影响与对照组比较，ODE浓度为50 mg/L时,Bax蛋白表达增多,而Bcl?2蛋白表达下降（图2）.
　　3讨论
　　鬼臼毒素类药物如VP16等是典型的细胞凋亡诱导剂，我们也发现邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素能诱导骨肉瘤OS?9901细胞凋亡. 一般认为，细胞内离子稳态的紊乱是细胞凋亡或死亡的最主要原因，也是大多数化疗药物作用的结果. Ca2+是细胞内一个重要的调节细胞生长、分泌和信号转导等机制的第二信使之一［8］. 目前，Mg2+对细胞凋亡的影响尤其引人注目，因为细胞内Mg2+是真核细胞最富有的二价金属离子，假若没有细胞内Mg2+， Ca2+共存，Ca2+行使第二信使的功能则是不完整的，Ca2+要引起反应必需Mg2+［9］. 本研究中，邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素使SOSP?9607细胞内的Ca2+和Mg2+浓度明显增加，这表明Mg2+可能辅助Ca2+共同增强核酸内切酶的活性而诱导细胞凋亡.
　　A:对照； B: bax表达； C: 对照； D: bcl?2表达.
　　图2ODE(50 mg/L)对骨肉瘤SOSP?9607细胞内bax和bcl?2表达的影响（略）
　　目前认为，正常情况下，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔具有调节线粒体膜通透性的作用，绝大多数转换孔处于关闭状态，当线粒体跨膜电位降低时转换孔开放，导致线粒体膜通透性增大，使细胞凋亡的启动因子如凋亡蛋白激活因子（APAF）和凋亡诱导因子（AIF）等从线粒体内释放出来，线粒体内膜通透性增大，线粒体内膜的跨膜电位下降［10-11］，引起细胞凋亡. 另外，pH值的下降也是细胞凋亡的生化特征之一. 细胞内酸度增强，可通过直接启动凋亡途径或对控制凋亡的酶促反应的允许作用，在凋亡过程中扮演着重要的角色［12］.
　　事实上细胞凋亡是一个基因调控的复杂的生物学过程，由许多体内、体外的因素控制. Bcl?2家族是调节细胞凋亡的主要基因. Bax基因编码Baxα， Baxβ， Baxγ三种蛋白质. Bax与Bcl?2形成的异源二聚体会抑制Bcl?2的功能. 因此认为细胞内的Bax与Bcl?2两者的含量之比决定该细胞受刺激后的生存与凋亡［13］. 我们的研究结果表明，ODE能降低Bcl?2蛋白表达、增强Bax蛋白表达. 说明ODE的诱导细胞凋亡作用与抗凋亡基因Bcl?2被抑制，促凋亡基因Bax被激活有关.
　　我们的研究表明，邻?氨基酚去甲表鬼臼毒素在体外实验中能明显抑制骨肉瘤SOSP?9607细胞生长，其作用机制可能与增加骨肉瘤细胞内Ca2+和Mg2+浓度，降低细胞内pH值和线粒体膜电位，改变细胞内的Bax与Bcl?2两者含量之比值而诱导肿瘤细胞凋亡有关.
【】
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