颈椎间盘退变过程中细胞凋亡与Bax，Caspase?3的表达

【摘要】  目的： 检测人颈椎间盘组织中的细胞密度、细胞凋亡率以及Bax和Caspase?3的表达. 方法： 实验组椎间盘标本来自颈前路椎间盘切除椎间融合手术的患者，所有病变节段均经MRI证实. 对照组标本为无脊柱相关疾病史的青年死亡者新鲜尸检颈椎间盘. 采用组织形态学观察法和TUNEL法检测人颈椎间盘中的凋亡细胞，用免疫组织化学S?P法检测Bax及半胱胺酸蛋白酶蛋白?3(Caspase?3)的表达. 结果： 实验组内的细胞密度均低于对照组；实验组内的TUNEL阳性细胞率均高于对照组；实验组髓核内Bax，Caspase?3染色阳性细胞率均高于对照组(P<0.01). 将对照组和患者组全部50例颈椎间盘标本合并后进行相关分析，对照组和实验组颈椎间盘TUNEL阳性细胞率与细胞密度间呈负相关；两组髓核内Bax, Caspase?3阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关(P<0.01). 结论： 细胞密度下降参与了人颈椎间盘的退变过程. 细胞凋亡是椎间盘髓核细胞减少的原因之一，通过调控Bax和Caspase?3的表达可降低人颈椎间盘内的细胞凋亡率，延缓人颈椎间盘的退变.

【关键词】  颈椎间盘 退变 凋亡 Bax 半胱胺酸蛋白酶蛋白?3

　　0引言

　　目前对颈椎病的主要是缓解颈椎间盘退变及其继发病理改变引起的脊髓、神经压迫，并非针对颈椎间盘退变本身，而且手术切除病变椎间盘并融合相应脊柱节段后往往造成相邻椎间盘的加速退变. 在电镜观察到髓核内有典型坏死细胞，可是对椎间盘细胞凋亡的研究近几年才刚开始，用TUNEL法检测到椎间盘中存在着以凋亡方式进行死亡的细胞，并且发现手术切除的椎间盘标本中的细胞凋亡率明显高于正常对照［1-2］，他们推测细胞凋亡在椎间盘退变过程中发挥了重要作用. 为进一步理解细胞凋亡在椎间盘退变过程中所起的作用并阐明参与椎间盘细胞凋亡的信号传导途径，这有助于将来通过干预细胞凋亡达到防治椎间盘退变的目的.

　　1材料和方法

　　1.1材料实验组30个椎间盘标本来自2006?05/12西安大学医学院第一附属骨科颈前路椎间盘切除椎间融合手术的患者，男21例，女9例，年龄30.7(51.1±10.3)岁，所有病变节段均经MRI证实. 对照组20个标本无脊柱相关疾病史的5例青年男性死亡者新鲜尸检颈椎间盘，年龄24.4(30.8±4.7)岁. 对照组颈椎间盘于取材对象死亡后15 min内取出. 所有50个标本离体后10 min内置入100 g/L中性甲醛溶液中，固定48 h，100 g/L中性EDTA溶液脱钙4～5 wk(以大头针能刺穿椎间盘所带的椎体骨组织为准)，按常规病理步骤逐级脱水、石蜡包埋，于各颈椎间盘的正中矢状面连续切片，片厚4 μm，捞取组织片并标注病理号，置60℃恒温烤箱内烤片3 h，使组织片紧密粘附于载玻片. TUNEL试剂盒(德国Promega公司产品)，浓缩型鼠抗人Bax单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)，浓缩型鼠抗人Caspase?3单克隆抗体(美国Santa Cruz公司产品)，即用型超敏S?P9002免疫组织化学试剂盒(美国Zymed公司产品)；倒置光学显微镜及成像系统（德国Leica?Q550cw）.

　　1.2方法

　　1.2.1常规HE染色组织切片常规脱蜡，梯度乙醇逐级水化，苏木素染色后自来水冲洗，伊红复染，梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜检查.

　　1.2.2TUNEL染色(1)石蜡切片常规脱蜡至水,蒸馏水漂洗5 min×3次; (2)3 mL/L过氧化氢甲醇50 μL/片，室温、湿盒内作用20 min,蒸馏水漂洗3 min×2次，PBS漂洗5 min;(3)将切片浸入0.01 mol/L构椽酸盐缓冲液(pH 6.0)并置于微波炉内，350 W修复5 min,室温冷却30 min，PBS漂洗3 min×3次; (4)正常山羊血清50 μL/片，室温、湿盒内作用20 min, PBS漂洗3 min×3次；(5)滴加TUNEL混合反应液(由含有核昔酸混合液的反应液和末端脱氧核糖核酸转移酶混合而成)25 μL/片，塑料薄膜覆盖，37℃湿盒内孵育60 min, PBS漂洗3 min×3次；(6)滴加POD转换剂(酶标记抗荧光素抗体)25 μL/片，塑料薄膜覆盖，37℃湿盒内孵育30 min,PBS漂洗3 min×3次；(7)滴加新鲜配制的DAB显色剂50 μL/片，低倍光镜下控制显色时间. 显色适度后流水冲洗终止反应,苏木素复染2 min，自来水冲洗返蓝5 min,10 mL/L盐酸酒精分化10 s，自来水冲洗5 min,梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片.

　　1.2.3S?P免疫组织化学染色(1)石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水漂洗5 min×3次，30 mL/L过氧化氢50 μL/片，室温、湿盒内作用30 min，灭活内源性过氧化物酶活性，蒸馏水漂洗3 min×2次，PBS漂洗5 min；(2)将切片浸入0.01 mol/L构椽酸盐缓冲液(pH 6.0)并置于高压锅内，待放汽阀冒汽后计时15 min行抗原修复，室温冷却30 min，PBS漂洗3 min×3次；(3)正常山羊血清50 μL/片，室温、湿盒内作用30 min，阻断内源性生物素，倾去多余血清，不洗，滴加Ⅰ抗(1∶75稀释Bax, Caspase?3)50 μL/片,40℃, 湿盒内孵育12 h，室温恢复30 min，PBS漂洗3 min×3次；(4)滴加生物素标记的Ⅱ抗50 μL/片，室温、湿盒内孵育30 min，PBS漂洗3 min×3次；(5)滴加链霉菌抗生物素一过氧化物酶溶液50 μL/片，室温、湿盒内孵育30 min， PBS漂洗3 min×3次；(6)滴加新鲜配制的DAB显色剂50 μL/片，低倍光镜下控制显色时间. 显色适度后流水冲洗终止反应；(7)苏木素复染2 min,自来水冲洗返蓝5 min(测灰度值的切片不复染)，10 mL/L盐酸酒精分化10 s，自来水冲洗5 min，梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片.

　　1.2.4结果判断凋亡细胞和凋亡小体的观察采用Kerr等［3］和Wang等［4］的标准. 凋亡软骨细胞表现为软骨陷窝内细胞核棕黄或棕褐染色，伴或不伴核染色质边集或核碎裂［5］. 非凋亡细胞的胞核呈蓝染. Bax, Caspase?3染色结果中阳性细胞均表现为软骨陷窝内蓝染的胞核周围有黄或棕黄着色颗粒，伴或不伴细胞皱缩. 阴性细胞的胞质呈浅蓝着色. Bax, Caspase?3染色结果图像通过德国Leica?Q550cw倒置光学显微镜及成像系统采集到的未复染的免疫组化切片图像进行灰度值扫描. 一般以105 μm2为准. 统计图像中所有提取出的阳性信号，平均灰度值. 平均灰度值在图像分析中用来表示图像的透光率，分为256级，最黑为0级，最亮为256级. 平均灰度值越小，阳性染色越强，免疫反应性越高.
统计学处理：计量指标以x±s表示，用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，两样本均数的比较采用独立样本t检验，两指标相关采用Pearson相关分析，P<0.05作为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1凋亡细胞、凋亡小体和细胞密度HE染色观察对照组软骨细胞较多，可见散在分布的凋亡软骨细胞与凋亡小体(图1A). 实验组的细胞稀疏而基质丰富，可见较多散在分布的凋亡软骨细胞与凋亡小体(图1B). 对照组和实验组颈椎间盘髓核内细胞密度分别为8.80±1.06，7.15±0.83，两组间差异有统计学意义(P<0.01).

　　2.2T凋亡细胞率UNEL染色中凋亡软骨细胞的细胞核呈棕黄或棕褐色着色，多伴有核染色质边集或浓集、核碎裂、核固缩(图1C，D). 实验组和对照组TUNEL染色阳性细胞率分别为11.85±0.87，7.08±0.87，两组间差异有统计学意义(P<0.01).

　　2.3SP免疫组织化学染色观察Bax, Caspase?3的表达对照组和实验组Bax染色阳性细胞和Caspase?3染色阳性细胞均呈散在分布，有些Bax阳性细胞和Caspase?3阳性细胞的胞膜发生皱缩，与软骨陷窝的边缘之间出现空晕（图2A，B，C，D）. 实验组和对照组颈椎间盘髓核内Bax，Caspase?3染色阳性细胞率分别为19.29±1.18，11.02±1.18和15.07±0.97，9.01±1.00；两组间的差异均有统计学意义(P<0.01).

　　A，C： 对照组； B，D： 实验组.

　　图1髓核内细胞变化（A，B）髓核内凋亡细胞（C，D）SP ×400（略）

　　A, C： 对照组； B, D： 实验组.

　　图2颈椎间盘髓核Bax（A，B）和Caspase?3（C，D）阳性细胞SP ×400（略）

　　2.4Bax, Caspase?3的平均灰度值对照组和实验组颈椎间盘髓核内Bax，Caspase?3的平均灰度值结果分别为：187.33±7.88，124.98±6.69；185.68±3.26，160.13±4.37；两组间的差异均有统计学意义(P<0.01). 平均灰度值越高，说明其免疫组织化学的染色越浅，含量越低，阳性率越低.

　　2.5TUNEL阳性细胞率与细胞密度将对照组和患者组全部50例颈椎间盘标本合并后进行相关分析，对照组和实验组内TUNEL阳性细胞率与细胞密度间经Pearson相关分析均呈负相关，均有统计学意义（r=-0.88; r=-0.93,P<0.01）. 对照组和实验组经Pearson相关分析，两组Bax阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率之间呈正相关，有统计学意义（r=0.83，P<0.01）；两组Caspase?3阳性细胞率与TUNEL阳性细胞率之间也呈正相关，有统计学意义（r=0.91，P<0.01）.

　　3讨论

　　Bax是用免疫共沉淀方法鉴定出来的第一个凋亡促进基因，为Bcl?2的同源基因［3-5］. 其蛋白是一个可溶性蛋白分子，主要位于细胞质中，当凋亡发生时，它随即转移到线粒体并与线粒体膜相结合［6］. Bax 能与Bcl?2构成异二聚体或与自身组成同二聚体，Bcl?2必需与Bax结合才能发挥其抗凋亡作用. 此外，Bax可在脂质膜上形成pH和电压依赖性离子转运通道，通过被动离子流和小分子物质促进细胞凋亡. 在pH=7.0和酸性环境下，Bax可引发脂质体包裹的碳氧荧光素释放，但在pH=7.5的情况下，Bcl?2能阻断Bax几乎所有的成孔活性［7］. 然而，Bax基因的表达并不立即导致细胞凋亡，而是仅在细胞接到死亡信号后Bax才开始发挥作用. 在本实验对照组和实验组颈椎间盘内髓核中，Bax，Caspase?3阳性细胞率和平均灰度值两组两个指标之间的差异均有非常显著意义，并且两组髓核内Bax，Caspase?3阳性细胞率和TUNEL阳性细胞率之间均呈正相关关系，有非常显著统计学意义，提示人颈椎间盘髓核内的软骨细胞可以通过由Bax和Caspase?3介导线粒体途径发生凋亡.

　　人的颈椎间盘突出髓核内有较多Fas(一个重要的细胞凋亡信号受体，又称死亡受体)阳性细胞和Fast(死亡受体配体)阳性细胞，作者因此认为椎间盘细胞的凋亡是通过死亡受体途径实现的. 这与本实验的结果并不矛盾，因为一方面同一种细胞可以经不同的途径发生凋亡. 另一方面，Li等［8］的研究提示在细胞凋亡过程中死亡受体途径和线粒体途径是可以交叉的，这或许可以解释Park等的结果与本实验的结果不同的原因. 虽然发现人的颈椎间盘软骨终板内有TUNEL阳性细胞，但在软骨终板内未检测到Bax阳性细胞和Caspase?3阳性细胞，因此，软骨终板内细胞凋亡的信号转导途径仍需进一步研究. 但这并不妨碍Bax和Caspase?3成为将来通过抑制细胞凋亡来颈椎间盘退变的可能的靶基因，Bax和Caspase?3的表达上调可能在人颈椎间盘髓核细胞的凋亡过程中起了一定作用，提示有可能在将来通过调控Bax和Caspase?3的表达来降低人颈椎间盘内的细胞凋亡率，从而延缓人颈椎间盘的退变. 因为在目前通过生物学方法防治椎间盘退变的动物实验中，均是把髓核作为实施治疗措施的靶部位［7-8］.

【】
  　　［1］ Ariga K, Yonenobu K, Nakase T, et al. Mechanical stress?induced apoptosis of endplate chondrocytes in organ?cultured mouse intervertebral discs:an ex vivo study［J］. Spine,2003,28(14):1528-1533.

　　［2］ Walsh AJ, Lotz JC. Biological response of the intervertebral disc to dynamic loading［J］. J Biomech,2004,37(3):329-337.

　　［3］ Ariga K, Miyamoto S, Nakase T, et al. The relatioship between apoptosis of endplate chondrocytes and aging and degeneration of the intervertebral disc［J］. Spine,2001,26(22):2414-2420.

　　［4］ Heraud F, Heraud A, Harmand MF. Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage［J］. Ann Rheum Dis,2000,59(12):959-965.

　　［5］ Sharif M, Whitehouse A, Sharman P, et al. Increased apoptosis in human osteoarthritic cartilage corresponds to reduced cell density and expression of caspase?3［J］. Arthritis Rheum,2004,50(2):507-515.

　　［6］ Tan J, Hu Y, Zheng H, et al. Construction of recombinant adenoviral vector Ad?CMV?hTGFbeta1 for reversion of intervertebral dsc degeneration by gene transfer［J］.Chin Traumatol,2002,5(2):97-102.

　　［7］ Rannou F, Lee TS, Zhou RH, et al. Intervertebral disc degenerationahe role of the mitochondrial pathway in annulus fibrosus cell apoptosis induced by overload［J］.Am J Pathol,2004,164(3):915-924.

　　［8］ Li R, Yang L, Lindhohn K, et al. Tumor necrosis factor death receptor signaling cascade is required for amyloid?beta protein?induced neuron death［J］.J Neurosci,2004,24(7):1760-1771.