低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖活性和NO分泌的影响

              作者：马彦卓，许旭东，韩凯，李飞，曹艳杰，张荣庆,王海昌   

【摘要】  目的： 观察不同作用时间下低频脉冲电磁场对大鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）增殖活性和NO分泌的影响. 方法： 密度梯度离心法获取大鼠骨髓单个核细胞,培养4 d后收集贴壁细胞，每日给予低频脉冲电磁场干预，磁场强度0.6 mT，频率15 Hz. 按作用时间的不同分为对照组（0 h）和磁场作用时间组(0.5，2，4，8 h组)，各组细胞培养及磁场干预3 d后,分别采用MTT比色法测定EPCs的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期，Griess法检测培养上清中NO水平. 结果： 对照组A490 nm为（0.37±0.07）, 0.5 h组（0.37±0.06）, 2 h组（0.40±0.09）与对照组（0.37±0.07）相比差异无统计学意义(P>0.05）；4 h组A490 nm值开始增加［(0.45±0.03） vs （0.37±0.07）; P<0.05］, 8 h组较对照组增加最为明显［（0.49±0.08） vs （0.37±0.07）；P<0.01］. 0.5 h组，2 h组细胞增殖指数PI（S+G2M）％与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05），4 h组，8 h组细胞增殖指数与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）. NO分泌随磁场作用时间的延长，其分泌增加. 结论： 低频脉冲电磁场可影响EPCs的增殖及NO分泌，随着作用时间的延长，细胞增殖及NO分泌增加.

【关键词】  电磁场;内皮祖细胞;细胞增殖；一氧化氮

　　0引言

　　内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作为性血管形成的研究靶点，已发现其不仅参与血管形成，也参与出生后血管生成［1］. 低频脉冲电磁场作为一种外来干预手段，已发现其可促进内皮细胞修复，促进内皮细胞FGF的分泌，提示低频电磁场对血管形成具有促进作用［2］. 我们采用体外培养大鼠骨髓EPCs,观察低频脉冲电磁场不同作用时间下骨髓EPCs增殖能力和NO分泌的变化及其时效关系,并探讨其相关作用机制，以期寻找一种新的促进血管生成的手段.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康雄性SD大鼠30只，体质量80～100 g（第四军医大学实验动物中心）；脉冲电磁场发生仪（第四军医大学生物医学工程系）；Ficoll淋巴细胞分离液（医学院生物工程医学研究所）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子（bFGF）（澳大利亚CYTOLAB公司）；FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC?UEA?I，美国Sigma公司）；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI?acLDL，美国Molecular Probe公司）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）；激光共聚焦显微镜（美国Bio?Rad公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1EPCs的分离、培养与鉴定［2-3］将大鼠颈椎脱臼处死后,取四肢骨用750 mL/L乙醇浸泡10 min，用5 mL注射器抽取培养液冲洗骨髓液,密度梯度离心法获取单个核细胞,将其接种予培养瓶中,在M199培养基(含100 mL/L FBS，VEGF 10 μg/L，bFGF 5 μg/L，L?谷氨酰胺300 mg/L，青霉素1×105U/L，链霉素100 mg/L，肝素1.25×104U/L)中培养,差异贴壁法培养4 h后，吸取上清置于新的培养瓶中继续培养4 d. 将培养4 d的细胞消化，接种于盖玻片上，24 h后将细胞爬片行Dil?ac?LDL与FITC?UEA?I直接免疫荧光双染. 向细胞爬片孔内加10 mg/L Dil?ac?LDL，37℃孵育10 h后，细胞爬片经40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS漂洗后加入10 mg/L FITC?UEA?I并于37℃避光孵育1 h，PBS洗涤同上，晾干后封片，激光共聚焦显微镜观察. FITC?UEA?和DiI?acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPCs.

　　1.2.2实验分组PEMFs发生仪频率15 Hz,磁感应强度:0～1.4 mT可调，线圈直径 200 mm. 调整两线圈距离至100 mm. 将线圈放置在孵箱中,刺激时将细胞放置在两线圈中间位置. 调整需要的强度和频率,实验分组按磁场强度分为对照组（不加磁场干预），0.2 mT, 0.6 mT和1.0 mT各组,贴壁细胞消化后,每组按每日干预时间的不同随机分成0.5，2，4，8 h各亚组. 即每日各组分别干预0.5，2，4 和8 h，共3 d.

　　1.2.3细胞活性检测如上述方法收集贴壁细胞并计数. 将等量EPCs接种到96孔培养板上,磁场干预3 d后，每孔加5 g/L MTT 20 μL,培养4 h后小心吸弃上清液,每孔加入DMSO 150 μL,于微量振荡器充分振荡10 min,使结晶充分溶解,在酶联免疫检测仪上测A490 nm,以空白培养液调零.

　　1.2.4细胞周期检测用上述方法消化收集贴壁细胞,再将等量EPCs接种到6孔板上,磁场干预3 d后，完全培养液以1000 r/min离心5 min后弃上清，加入冰冷的0.1 mol/L PBS以1000 r/min×5 min洗2次后弃上清，加入1 mL生理盐水制成单细胞悬液. 加预冷的无水乙醇2 mL快速混匀，固定细胞、用封口膜封口，4℃下保存1 h后弃固定液，用PBS洗2次（1000 r/min×5 min）后，加入0.1 mL PBS调整细胞密度，并加入1 mL DNA荧光染料，室温下避光染色15 min，置流式细胞仪分析. 细胞增殖指数(PrI). PrI=(S+G2/M)/(G0/G1+ S+G2/M)×100%.

　　1.2.5NO分泌检测如上述方法收集贴壁细胞并计数. 将等量EPCs接种到96孔培养板上,磁场干预3 d后，吸取上清，用Griess法测定培养基中NO的稳定代谢产物亚硝酸盐(NO2-) 浓度，测定方法按照NO试剂盒说明书操作, 在酶联免疫检测仪上测A490 nm值,按公式计算NO含量.

　　统计学处理：各组实验均重复3次. 计量资料以x±s表示,应用SPSS11.0统计软件处理,组间资料比较采用ANOVA,组间两两比较采用LSD?t检验,以P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1EPCs的培养及鉴定图片培养的EPCs有贴壁生长的特性，刚分离出的细胞呈圆形，折光性强（图1A）；培养4 d后，细胞形态多样，为单核，多边形及短梭形（图1B）. 用DiI?acLDL和FITC?UEA?Ⅰ对细胞染色后,通过共聚焦显微镜鉴定,此双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs(图2).

　　A： 圆形单个核细胞； B： 短梭形及多边形细胞.

　　图1倒置显微镜下内皮祖细胞的形态×200（略）

　　A： FITC?VEA?I染色； B： Dil?ac?LDL染色； C： 双染阳性的EPC.

　　图2激光扫描共聚焦显微镜检测内皮祖细胞的表面标志×200（略）

　　2.2磁场不同作用时间对骨髓EPCs增殖活性的影响经暴磁培养3 d后，EPCs增殖活性0.5 h组为（0.37±0.06），2 h组为（0.40±0.09），与对照组（0.37±0.07）相比较，差异无统计学意义（P>0.05). 4 h组(0.45±0.03)的EPCs数量开始增加，与对照组相比较，差异具有统计学意义（P<0.05)，8 h组（0.49±0.08）较对照组增加最为明显.

　　2.3磁场不同作用时间对骨髓EPCs细胞周期的影响经暴磁培养3 d后，反映细胞增殖活力的PrI（S+G2M）％，0.5 h组和2 h组与对照组相比差异无统计学意义［(7.80±0.80） vs （7.93±0.57）；（7.77±0.15） vs （7.93±0.57），P>0.05］. 但随着时间的延长，4 h组细胞PrI与对照组相比差异有统计学意义［(11.20±2.59） vs （7.93±0.57）；P<0.05］,8 h组细胞PrI与对照组相比差异具有统计学意义［(14.70±2.01） vs （7.93±0.57）；P<0.01］.

　　2.4磁场不同作用时间对骨髓EPCs NO分泌的影响经暴磁培养3 d后，0.5 h组（3.76±0.98），2 h组（3.87±0.49） 和4 h组(4.13±0.74）与对照组（3.32±0.24）相比差异无统计学意义（P>0.05）；8 h组(5.13±0.65）与对照组相比较差异具有统计学意义(P<0.01).

　　3讨论

　　磁场具有多方面的生物效应. 在血管形成方面，已发现脉冲电磁场可促进内皮细胞增殖，加快血管内皮损伤处再内皮化过程，并可促进心梗后血管形成［4-6 ］. Tepper等［1］发现低频脉冲电磁场可促进血管新生，并推测这一作用与内皮细胞FGF?2分泌增加有关.

　　EPCs是一类能增殖并分化为血管内皮细胞,是血管形成的前体细胞. 但生理情况下,循环EPCs的数量相对较少,尤其在一些病理条件下,EPC的数目及活性会下降. Hill等［7］和Vasa等［8］分别报道冠心病患者循环血中的EPC数量下降了近50％，迁移能力受损，并与危险因子的数目成反向线性关系，而且高危者EPC更易老化. 因而人们采用各种手段来增加EPC的数量，促进冠心病患者血管新生和内皮修复. Kawamoto等［9］发现体外扩增的EPCs注入心肌缺血模型中，可促进缺血部位血管形成. 但低频脉冲电磁场对EPCs作用的研究报道较少.

　　我们的结果提示,同一磁场强度下，不同磁场作用时间可影响EPCs增殖活性，具有时间累积效应，短时间内与对照组相比并无统计学差异，随着作用时间的延长，表现出促进细胞增殖的效应. 从细胞周期代谢过程来看．细胞周期各时期的DNA含量不同，G1期是DNA合成前期，S期是DNA合成期，增殖旺盛的细胞处于S期的比例较高. (S+G2M) (Pr1)就代表了该群体中增殖期细胞的数量，可反映出细胞增殖的状态 . 我们采用流式细胞仪检测细胞周期，结果发现磁场照射4 h以后，处于增殖期的细胞数量开始增加，这与上述结果一致. 说明低频脉冲电磁场可促进EPCs的增殖.

　　NO作为迄今为止体内最简单的信息传递分子，已发现其具有舒张血管，抗凋亡等作用，Stefania等［10］发现NO可促进内皮细胞增殖、迁移及管腔形成. 我们发现低频脉冲电磁场作用8 h后NO分泌增加. 总之，低频脉冲电磁场可增加体外培养的EPCs的数量，促进NO分泌，这种作用可能与其对NO的生物合成、释放、运转等刺激有关，其具体机制还有待于进一步的研究.

【】
  　　［1］ Tepper OM, Callaghan MJ, Chang EI, et al. Electromagnetic fields increase in vitro and in vivo angiogenesis through endothelial release of FGF?2［J］. FASEB J，2004,18(11):1231-1233.

　　［2］ Hill JM， Zalos G， Halcox JP， et al. Circulating endothelial progenitor cells， vascular fun?ction， and cardiovascular risk［J］. N Eng J Med，2003，348(7)：593-600.

　　［3］ Kalka C, Masuda H, Takahashi T， et al. Transplantation of ex vivo expanded endothelial prog? enitor cells for therapeutic neovascularization［J］. Proc Natl A2cad Sci USA, 2000, 97(7):3422-3427.

　　［4］ Kawamoto A, Gwon HC, Lwaguro H, et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia［J］. Circulation， 2001，103:634-637.

　　［5］ Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone?marrow?derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiacfunction［J］. Nat Med，2001，7:430-436.

　　［6］ Assmus B, Schachinger V, Teupe C, et al. Transplantation of Progenitor Cells and Regenera?tion Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE?AMI) ［J］. Circulation，2002，106:3009-3017.

　　［7］ Hill JM, Zalos G, Halcox JP, et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk［J］. N Engl J Med，2003，348:593-600.

　　［8］ Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A, et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease［J］. Circ Res，2001，89：1-7.

　　［9］ Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia［J］. Circulation，2001，103:634-637.

　　［10］ Stefania B, Cristiana P, Andrea C， et al. A Cellular System to Study the R?ole of Nitric Oxide in Cell Death, Survival, and Migration［J］. Neurotoxicology，2005，26 (5)：841-845.